[发明专利]酮还原酶、核酸、重组表达载体、重组表达菌株及应用

权利要求书

1.一种酮还原酶，其特征在于：所述酮还原酶的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。

2.一种编码权利要求1所述酮还原酶的核酸。

3.一种包含权利要求2所述核酸的重组表达载体。

4.一种包含权利要求3所述重组表达载体的重组表达菌株。

5.权利要求4所述重组表达菌株的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：

(a)将权利要求3所述重组表达载体转化到宿主细胞，涂布在含有50μg/mL氨苄的LB平板上，37℃过夜培养后，从中挑选阳性菌落接种到50mL液体LB培养基中进行培养；培养4h后，吸取10ml种子液转入1L新鲜的LB液体培养基；

(b)当培养的浓度达到OD₆₀₀＝0.6-1.0时，加入终浓度为0.05～1.0mmol/L的异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷进行诱导，诱导温度为16-35℃，诱导培养8-16h，诱导培养后通过离心或浓缩得到更高浓度的湿菌体，经过超声波破碎或者高压均质机破碎后离心收集上清液，即为重组表达菌株的粗酶裂解液。

6.根据权利要求5所述重组表达菌株的制备方法，其特征在于：步骤(a)中所述液体LB培养基成分为：蛋白胨10g/L，酵母膏5g/L，NaCl 10g/L，pH 7.2；所述宿主细胞为大肠杆菌E.coli BL21；步骤(b)中加入终浓度为0.15mmol/L的异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷进行诱导，诱导温度为28℃，诱导培养12h。

7.权利要求1所述酮还原酶在不对称还原制备(S)-1-叔丁氧羰基-3-羟基哌啶中的应用，其特征在于：在pH 6.0～8.0的缓冲液中，在葡萄糖、葡萄糖脱氢酶和辅酶存在下，所述酮还原酶对前体羰基化合物进行不对称还原反应，形成(S)-1-叔丁氧羰基-3-羟基哌啶。

8.根据权利要求7所述酮还原酶在不对称还原制备(S)-1-叔丁氧羰基-3-羟基哌啶中的应用，其特征在于：包括以下步骤：

(1)在烧瓶中加入500ml 50mM的磷酸盐缓冲液，所述磷酸盐缓冲液pH为6.0-8.0，搅拌；

(2)再加入所述酮还原酶，葡萄糖脱氢酶和葡萄糖，再加入NAD辅酶以及前体羰基化合物，再用磷酸盐缓冲液定容，在25-35℃温度下反应，用2mol/L的氢氧化钠控制pH，反应16h后用TLC点板检测反应完全；

(3)将反应体系升温至70℃加热2h，加入硅藻土过滤除蛋白，用等体积乙酸乙酯萃取水相和洗涤滤饼；

(4)萃取两次后合并有机相，用无水硫酸钠干燥后减压旋蒸得油状物粗品，即得(S)-1-叔丁氧羰基-3-羟基哌啶。

9.根据权利要求8所述酮还原酶在不对称还原制备(S)-1-叔丁氧羰基-3-羟基哌啶中的应用，其中，步骤(2)中所述NAD辅酶为NAD⁺或NADP⁺，所述NAD辅酶的用量为0.01～0.1g/L；所述前体羰基化合物为N-Boc-3-哌啶酮，所述N-Boc-3-哌啶酮在反应液中的浓度为10-200g/L；所述酮还原酶的用量为100～1000U/L；所述葡萄糖的用量为20～200g/L，所述葡萄糖脱氢酶的用量为100～2000U/L，所述葡萄糖的浓度为所述前体羰基化合物的1.2-1.5当量。

10.根据权利要求8-9任意一项所述酮还原酶在不对称还原制备(S)-1-叔丁氧羰基-3-羟基哌啶中的应用，其特征在于：步骤(1)中所述磷酸盐缓冲液pH为7.0，步骤(2)中在30℃温度下反应。