[发明专利]一种蚯蚓中蚯蚓蛋白和蚓激酶的提取方法

权利要求书

1.一种蚯蚓中蚯蚓蛋白和蚓激酶的提取方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)取新鲜饱满活蚯蚓，水洗数次，尽最大可能使其内脏中的污物排出，然后捞出用滤纸尽量吸其多余水分；

(2)加入4℃预冷的0.1mol/LpH7.8的磷酸缓冲液于匀浆器中匀浆5分钟，在4℃冰箱中静置4小时，后高速离心，弃去沉淀，得上清液；

(3)取上清液加固体硫酸铵达35％饱和度，4000r/min，离心10min，收集上清液，再加入固体硫酸铵达70％饱和度，静置过夜，高速离心，收集沉淀，后用0.1mol/L磷酸缓冲液溶解此沉淀物，过滤得粗蛋白溶液；

(4)将粗蛋白溶液加去离子水脱盐，浓缩至浓缩液呈中性(pH7.0)，浓缩度达到5％时进入真空冷冻干燥机干燥5‐20小时，即得蚯蚓蛋白冻干粉；

(5)将蚯蚓蛋白冻干粉加入0.1mol/LpH7.8的磷酸缓冲液溶解，两端过20000da‐40000da超滤膜，得截留液A和滤过液B；

(6)将截留液A加去离子水脱盐，浓缩至浓缩液呈中性(pH7.0)，浓缩度达到5％时进入真空冷冻干燥机干燥5‐20小时，得到冻干蚓激酶；

(7)将步骤(3)所得粗蛋白溶液加入蛋白酶酶解，采用射频辅助酶解，过6000da超滤膜，将滤过液加去离子水脱盐，浓缩至浓缩液呈中性(pH7.0)，浓缩度达到5％时进入真空冷冻干燥机干燥5‐20小时，得到6500da类泛素蚯蚓多肽。

2.根据权利要求1所述的一种蚯蚓中蚯蚓蛋白和蚓激酶的提取方法，其特征在于，步骤(2)中所述磷酸缓冲液还可以加入0.1％‐0.5％的氯化钠或柠檬酸钠或磷酸氢二钠或碳酸氢钠或碳酸钠水溶液。

3.根据权利要求1所述的一种蚯蚓中蚯蚓蛋白和蚓激酶的提取方法，其特征在于，步骤(3)所述高速离心采用转速15000‐25000r/min，卧式螺旋离心机。

4.根据权利要求1所述的一种蚯蚓中蚯蚓蛋白和蚓激酶的提取方法，其特征在于，步骤(5)所述超滤膜还可以是透析袋，透析液为0.02mol/L磷酸缓冲液。

5.根据权利要求1所述的一种蚯蚓中蚯蚓蛋白和蚓激酶的提取方法，其特征在于，步骤(5)中所述超滤膜柱体填料为葡聚糖或琼脂糖中的一种。

6.根据权利要求1所述的蚯蚓中蚯蚓蛋白和蚓激酶的提取方法，其特征在于，步骤(7)中所述蛋白酶是指中性蛋白酶和胰蛋白酶。

7.根据权利要求1所述的一种蚯蚓中蚯蚓蛋白和蚓激酶的提取方法，其特征在于，所述蚯蚓蛋白和蚓激酶的提取方法，其辅助条件为频率10MHz‐200MHz的射频系统。