[发明专利]一种高轮环藤宁和千金藤素含量的地不容的组培繁育方法

说明书

本发明提供了一种高轮环藤宁和千金藤素含量的地不容的组培繁育方法，本方法包括如下步骤：地不容外植体的选取与消毒处理后，接种到腋芽诱导培养基上，将获得的腋芽切下转入培养基进行带芽愈伤诱导，然后将带芽愈伤转接到不定芽培养基上诱导不定芽的分化，不定芽的数量达10～20个/40天，添加嘧啶醇抑制芽的伸长并诱导生根，炼苗后移栽，成活率达90％以上；本方法适合工业化生产，具有繁殖速度快、扩增系数大、保持原有品种的优良性状等优点。

技术领域

本发明涉及一种高轮环藤宁和千金藤素含量的地不容的组培繁育方法，属于植物领域。

技术背景

地不容(Stephania epigaea)是防己科(Menispermaceae)千金藤属(Stephania)山乌龟亚属植物，本属植物具有硕大块根且裸露于地面形似乌龟，因此别名称“山乌龟”，是我国的传统中草药，其块根入药，在长江流域以南各地尤其是华南和西南等地少数民族中使用广泛。

地不容富含千金藤素、轮环藤宁等生物碱，前者用于白细胞增生剂千金藤素片的研药，后者是环轮宁(轮环藤宁双溴甲烷盐)的前体。通过在滇西、滇西南和部分广西等地野外地不容资源调查，对不同生态位的30个地不容居群，每个居群分别选雌、雄株各20株，共600余株，选裸露于地面块茎直径在10～20cm的药用部位进行高效液相含量测定，筛选得到雌株和雄株雄中高含千金藤素(cepharanthine)和轮环藤宁(cycleanine)的品系

高轮环藤宁和千金藤素含量的地不容在组培中也存在有诸多问题，例如芽增殖系数偏低，生根困难等技术难题。黄宁珍等(2007，广西地不容组培快繁研究)以嫩茎节段为外植体，在MS+BA 1.0mg·L^-1+NAA 0.1mg·L^-1培养基上先诱导出芽，再经过3种培养基交替培养，增殖系数也仅为6.0倍/50d。发明人在实验研究地不容组培快繁中发现，芽增殖过程中，激素BA浓度在1.0～3.0mg·L^-1时，偏向于愈伤组织的形成，对芽的增值效果不佳，把带芽的愈伤组织转接到MS+BA 0.4～0.8mg·L^-1+NAA 0.2mg·L^-1上有不定芽的分化，而切除上部芽的愈伤很难分化出不定芽，需要更长时间的诱导且数量极少，原因可能是愈伤上部的芽合成一些微量物质而促进不定芽的分化，而使用文献中提供的生根培养基无法使高轮环藤宁和千金藤素含量的地不容生根，直接造成无法获得能够成活的地不容组织。

综上所述，目前高轮环藤宁和千金藤素含量的地不容的组培快速繁殖存在有增殖系数低、诱导不定芽难、生根难等技术问题，阻碍了地不容的快速繁殖。

发明内容

针对上述技术问题，发明人提供了一种高轮环藤宁和千金藤素含量的地不容的组培繁育方法，其中，所述组织繁育方法包括以下步骤：

1)芽诱导，选取高轮环藤宁和千金藤素含量的地不容带节嫩茎段为外植体，经过灭菌操作，接种到芽诱导培养基上培养，所述芽诱导培养基配方为1/2MS+BA

0～0.5mg·L^-1+IBA 0～0.2mg·L^-1，诱导新芽；

2)愈伤诱导，当新芽长到2～3cm后剪切转接到愈伤诱导培养基上培养，所述愈伤诱导培养基为MS+BA1.0～2.0mg·L^-1+NAA 0.2mg·L^-1，诱导带芽愈伤；

3)不定芽分化，将带芽的愈伤接到不定芽诱导分化培养基上培养，所述不定芽分化培养基配方为MS+BA0.4～0.8mg·L^-1+NAA 0.2mg·L^-1，诱导不定芽；

4)生根培养，剪切不定芽尖转接到生根培养基上培养，所述生根培养基配方为1/2MS+IBA 0.5～1.0mg·L^-1+嘧啶醇1.0～2.0mg·L^-1，诱导生根；