[发明专利]木聚糖酶HoXyn11A的突变体及其制备方法和用途

说明书

本发明涉及木聚糖酶HoXyn11A的S95T‑S164T突变体、编码该突变体的多核苷酸、重组载体、重组菌、制备该突变体的方法及该突变体的用途。其中，通过对氨基酸序列为SEQ ID No.3的木聚糖酶进行S95T‑S164T突变，获得木聚糖酶HoXyn11A的S95T‑S164T突变体。与野生型的木聚糖酶HoXyn11A相比，木聚糖酶HoXyn11A的S95T‑S164T突变体在保持木糖降解活性的同时，表现出良好的热稳定性。

技术领域

本发明涉及蛋白质工程领域。具体而言，本发明涉及通过对木聚糖酶HoXyn11A的关键位点进行点突变，获得热稳定性更好的木聚糖酶HoXyn11A的突变体。

背景技术

根据已有的报道，广义上的木聚糖酶分为三种，分别是β-1,4-D-内切木聚糖酶(EC3.2.1.8)、β-1,4-D-外切木聚糖酶(EC 3.2.1.92)以及β-木糖苷酶(EC 3.2.1.37)。其中，β-1,4-D-内切木聚糖酶(EC 3.2.1.8)是降解木聚糖的最主要的酶，该酶作用于β-1,4-木聚糖的主链，并以内切的方式水解木聚糖中的β-1,4-糖苷键，该酶降解木聚糖产生低聚木糖等水解产物。β-1,4-D-外切木聚糖酶(EC 3.2.1.92)作用于寡聚木糖及木聚糖的非还原端。Β-木糖苷酶通过水解低聚木糖的末端来催化释放木糖残基。此外，狭义的木聚糖酶是指β-1,4-D-内切木聚糖酶(EC 3.1.2.8)，该酶目前已广泛应用于生物能源、造纸、食品、饲料行业。

目前已知木聚糖酶属于糖基水解酶的一种，根据其氨基酸序列、三维结构、催化位点的几何学性质，木聚糖酶可归类为第5家族、第7家族、第10家族(即F家族)和第11家族(即G家族)等。

此外，根据现有的研究发现，第10家族木聚糖酶的来源主要包括：地细菌、海洋藻类、真菌、酵母菌；第11家族木聚糖酶的来源主要包括：黑曲霉(Aspergillus niger)、里氏木霉(Trichoderma reesei)、短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)、枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)、变青链霉菌(Streptomyces lividans)、哈茨木霉(Trichoderma harzianum)、粪肥纤维单胞菌(Cellulomonase fimi)、环状芽孢杆菌(Bacillus circulans)等。

木聚糖酶具有如下的功能区：催化结构域(Catalytc Domains，CD)、碳水化合物结合结构域(carbohydrate-binding module，CBM)或纤维素结合结构域(Cellulose BindingDomains，CBD)、木聚糖结合结构域(Xylan bindin gDomains，XBD)、连接序列(Linkersequence)和重复序列(Repeated sequences)。其中，F/10家族木聚糖酶的催化结构域具有(β/α)8桶状结构，即TIM桶状结构；(β/α)8桶状结构在酶结构中十分常见，其中，由β折叠和α螺旋构成二级结构的框架，而环包含同其催化活性相关的氨基酸。F/10家族木聚糖酶的疏水核心只包含形成β折叠的残基。β折叠和α螺旋的相对位置主要靠具有支链的疏水氨基酸缬氨酸、异亮氨酸和亮氨酸来维持。F/10家族木聚糖酶一般具有碳水化合物结合结构域CBM，而仅有少数G/11家族木聚糖酶具有CBM。G/11家族木聚糖酶的结构主要为β折叠，蛋白整体呈“右手”型。其中，8种G/11家族木聚糖酶的三维结构为“三明治”形状，包括1个α螺旋和2个β折叠，形成能容纳1个木聚糖聚合物的巨大的间隙。

木聚糖酶三维结构中各功能区一般由富含羟基的连接序列(即，环)相连。所述环包含有较多的丝氨酸、脯氨酸或苏氨酸残基，并高度糖基化，从而能够有效抑制外源蛋白酶对酶分子的降解。连接序列通常富含柔性氨基酸，从而形成柔韧的铰链区，使得各个结构域在空间上分离，并在宏观上表现为无规则卷曲。这样的排列有助于结构域各自发挥功能并维持空间构象的稳定。研究表明，连接肽可辅助木聚糖酶经由CBM锚定于细胞壁表面，以催化降解复杂底物。