[发明专利]一种蜕膜间充质干细胞的制备方法

说明书

本发明公开了一种蜕膜间充质干细胞的制备方法：步骤1、分离；步骤2、初处理；步骤3、过滤；步骤4、接种和培养；步骤5、传代；步骤6、细胞冻存；步骤7；细胞复苏。本发明拟从原料采集开始直至细胞制备完成的全过程进行统一、系统监控，从胎盘采集前的筛选开始直至细胞制备成成品中间品及终产品的质量全部受控。

技术领域

本发明涉及细胞生物学领域，特别是涉及一种间充质干细胞的制备方法。

背景技术

干细胞(stem cell)是一类具有自我复制能力的多潜能细胞。在一定条件下，它可以分化成多种功能细胞。根据干细胞所处的发育阶段分为胚胎干细胞(embryonic stemcell，ES细胞)和成体干细胞(somatic stem cell)。根据干细胞的发育潜能分为三类：全能干细胞(totipotent stem cell，TSC)、多能干细胞(pluripotent stem cell)和单能干细胞(unipotent stem cell)(专能干细胞)。干细胞(Stem Cell)是一种未充分分化，尚不成熟的细胞，具有再生各种组织器官和人体的潜在功能，医学界称为“万用细胞”。干细胞存在所有多细胞组织里，能经由有丝分裂与分化来分裂成多种的特化细胞，而且可以利用自我更新来提供更多干细胞。干细胞的来源有很多，包括胎盘、脐带、脐带血与骨髓等。

间充质干细胞(Mesenchymal Stem Cells，MSCs)是一类具有多向分化潜能、低免疫原性的成体干细胞，具粘附性，呈纺锤型、成纤维细胞样形态，在胚胎发育中来源于中胚层，具有分化为多种中胚层细胞系的潜能，包括骨细胞、脂肪细胞、软骨细胞、成纤维细胞、肌腱细胞等。MSCs广泛地存在于人体的骨髓、脂肪、牙周膜、新生儿的脐带、胎盘、羊膜、羊水等组织中，来源广泛且没有伦理限制，易于分离和体外扩增，在经过多次分裂传代后仍保持多向分化潜能，至今为止的临床试验研究未发现MSCs有严重副作用，是一种非常理想的细胞治疗和再生医学的种子细胞。

从细胞表型特征来看，目前并没有发现MSCs有某种特异性的细胞表型标记，而通常认为MSCs不表达造血干细胞的表面标记如CD45、CD14、CD11，及一些共刺激分子如CD80、CD86、CD40和CD31。一般认为MSCs表达CD105、CD73、CD44、CD90、CD106、CD29等。2006年国际细胞治疗协会(ISCT)间充质组织干细胞委员会对间充质干细胞的最低标准做了规定：第一，MSCs必须是可以在塑料培养器皿中贴壁生长的细胞；第二，MSCs流式检测必须≥95％表达CD105，CD73，CD90抗原，同时必须≤2％表达CD45，CD34，CD14，CD11b，Cd79α和HLA II；第三，MSCs必须具备在体外诱导称为成骨细胞、脂肪细胞、软骨细胞的能力。因此，一般通过以上三点综合鉴定MSCs。

蜕膜间充质干细胞(Decidua-derivedmesenchymalstemcells，DMSCs)除了具有间充质干细胞一般表型及分化潜能外,还具有低免疫原性等独特性质,是一种多能基质细胞。蜕膜间充质干细胞不但为妊娠期间胚胎植入提供适宜环境,而且通过表达免疫调控因子与多种免疫细胞相互作用,如T细胞、NK细胞及DC等,发挥其在胚胎植入、免疫耐受建立及正常妊娠维持中的重要作用。目前蜕膜间充质干细胞已经应用于再生治疗,具有较高的临床应用价值。