[发明专利]一种蜕膜间充质干细胞的制备方法

权利要求书

1.一种蜕膜间充质干细胞的制备方法，所述制备方法包括如下步骤：

步骤1：分离：将胎盘组织用无菌盐水冲洗后，小心分离脐带和胎盘底蜕膜组织，将脐带和底蜕膜组织分开操作；

步骤2：初处理：分别将步骤1中的脐带和胎盘底蜕膜组织剪成小组织块，洗去两者中的血液成分，再加入胶原酶和胰酶消化小组织块。

步骤3：过滤：将消化后得到的混合液体经过滤网过滤掉不溶物质。

步骤4：接种和培养：将过滤后的混合液体分别接种于细胞培养瓶中，用含胎牛血清的DF12培养液于37℃、3～8％CO₂、饱和湿度的培养箱中培养。

步骤5：传代：待细胞生长至70～85％融合时，加入胰酶消化细胞，进行传代。

步骤6：细胞冻存：收集细胞并计数和活率，按3×10⁷/ml/管放入细胞冻存管，加入冷冻保护液，放入液氮罐中进行冷冻保存；

步骤7：细胞复苏：将细胞冻存管从液氮罐中取出，迅速放入37℃水浴中，不断摇动，2min中之内解冻，离心洗涤弃上清，获得蜕膜间充质干细胞，按照需求使用即可。

2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤2中，所述加入的胶原酶为Ⅰ型或者Ⅱ型。

3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤3中的滤网为200目滤网。

4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤4中胎牛血清的含量为6～15％。

5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤4中胎牛血清的含量为10％。

6.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤4中，CO2的浓度为5％。

7.根据权利要求1所述的的制备方法，其特征在于，加入胰酶的时机是细胞生产至70～80％。

8.根据权利要求1所述的的制备方法，其特征在于，加入胰酶的时机是细胞生产至80％。

9.根据权利要求1所述的的制备方法，其特征在于，步骤5中，进行传代的比例为1:3。

10.根据权利要求1所述的的制备方法，其特征在于，步骤6中，冷冻保存所用的细胞冷冻保护液由完全培养基和二甲基亚砜配制而成，其中二甲基亚砜终浓度8％。