[发明专利]一种牛胰蛋白酶原突变体、编码基因及其制备

说明书

本发明公开一种分泌型牛胰蛋白酶原突变体基因，以及编码的牛胰蛋白酶原突变体，含有该基因的重组表达载体、基因工程菌及其制备方法。本发明通过所述牛胰蛋白酶原突变体基因转化形成一株高产胰蛋白酶工程菌株，发酵工艺和纯化工艺简单、表达效率高、产量高；生成的牛胰蛋白酶突变体转化的牛胰蛋白酶保留了胰蛋白酶原有的空间结构以及活性。

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种牛胰蛋白酶原突变体及其制备。

背景技术

胰蛋白酶(Trypsin,EC 3.4.21.4)是广泛存在的丝氨酸蛋白酶类，尤其是存在于哺乳动物消化系统及昆虫体内。哺乳动物由胰腺分泌胰蛋白酶，以酶原的形式存在，经过小肠分泌的肠激酶作用将胰蛋白酶原分解为具有活性的消化酶，主要作用于精氨酸或赖氨酸羧基端的肽键，同时还能限制分级糜蛋白酶原、羧肽酶原、磷脂酶原等酶原前体。

胰蛋白酶在医学上可以对脓胸，血胸，溃疡，外科炎症以及外科创伤性损伤等都具有一定的临床作用，对毒蛇咬伤也有一定的缓解作用，还常用于动物细胞培养前对组织的处理。临床上用于脓胸、血胸、外科炎症、溃疡、创伤性损伤等所产生的局部水肿、血肿及脓肿等。除此之外在工业生产中，胰蛋白酶尤其在重组人胰岛素以及胰岛素类似物的生产过程中尤为重要，且是能够决定胰岛素收率的一个重要因素之一。

目前制备胰蛋白酶的方法主要有两类：一是提取自动物如牛、猪、羊等的胰脏，因其来源广，制备方法相对简单被广泛采用。但是该方法因不能完全去除其它蛋白质，且提取的动物源病毒如口蹄疫病毒、疯牛病病毒等都不能完全去除，因此其在医药应用上存在对人体的免疫原性危害。第二种是以基因重组的方法生产动物来源的胰蛋白酶，多以猪源性胰蛋白酶为主，且基因工程宿主多为大肠杆菌，但大肠杆菌表达常出现包涵体。专利201310043541.8公开了一种应用大肠杆菌可溶性表达牛胰蛋白酶的方法，该方法避免了形成包涵体，解决了因分子量大而难分泌表达的难题，但是该可溶性表达的牛胰蛋白酶因对大肠杆菌毒性较大而表达量较低。而采用酵母表达猪、牛胰蛋白酶原可以避免大肠杆菌包涵体变复性制备困难的缺点。

发明内容

本发明目的之一在于提供一种分泌型牛胰蛋白酶原突变体基因，以及编码的牛胰蛋白酶原突变体，含有该基因的重组表达载体、基因工程菌及其制备方法。

本发明提供的牛胰蛋白酶原突变体基因，其核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，或者由SEQ ID No.1中所示的核苷酸序列经过取代、缺失或者添加一个或者几个核苷酸且编码牛胰蛋白酶原的由SEQ ID No.1衍生基因。

本发明提供一种高酶活性的牛胰蛋白酶原突变体，其是：

(1)由SEQ ID NO.2所示氨基酸序列组成的蛋白质；

(2)或是由SEQ ID NO.2所示氨基酸序列经过取代、缺失或者添加一个或者几个氨基酸且能够生成具有酶活性的牛胰蛋白酶由SEQ ID NO.2衍生的蛋白质。

本发明的目的之二在于提供一种包含所述牛胰蛋白酶原突变体基因的重组表达载体。其可通过本领域常规方法将所述牛胰蛋白酶原突变体基因的核苷酸序列连接于各种载体上构建而成。所述的载体可以为本领域常规的能够用以表达外源蛋白的穿梭载体，这些能够用以表达外援蛋白的穿梭载体均含有表达外援蛋白所需要的分泌信号肽，优选以pPIC9k、pPIC3.5k、pPICZα、pA0815为基础改造的载体。进一步地，所述酵母表达载体为具有筛选标记的酵母表达载体，优选地，所述酵母表达载体的筛选标记为Zeocin、Geneticin或His4，本发明优选的实施方式为pPIC9k以及Geneticin筛选标记。

本发明的目的之三在于提供一种包含本发明的牛胰蛋白酶原突变体基因或其重组表达载体的基因工程菌，本发明优选的为酵母菌，进一步优选为毕赤酵母，更优选为毕赤酵母GS115。