[发明专利]一种牛胰蛋白酶原突变体、编码基因及其制备

权利要求书

1.一种牛胰蛋白酶原突变体基因，其核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，或者由SEQ IDNo.1中所示的核苷酸序列经过取代、缺失或者添加一个或者几个核苷酸且编码牛胰蛋白酶原的由SEQ ID No.1衍生基因。

2.一种高酶活性的牛胰蛋白酶原突变体，其是：

(1)由SEQ ID NO.2所示氨基酸序列组成的蛋白质；

(2)或是由SEQ ID NO.2所示氨基酸序列经过取代、缺失或者添加一个或者几个氨基酸且能够生成具有酶活性的牛胰蛋白酶由SEQ ID NO.2衍生的蛋白质。

3.一种包含权利要求1所述牛胰蛋白酶原突变体基因的重组表达载体。

4.根据权利要求3所述载体，其特征在于所述载体通过将权利要求1所述牛胰蛋白酶原突变体基因的核苷酸序列连接于各种穿梭载体上构建而成。

5.根据权利要求4所述载体，其特征在于所述穿梭载体为以pPIC9k、pPIC3.5k、pPICZα、pA0815为基础改造的载体。

6.一种包含权利要求1所述牛胰蛋白酶原突变体基因或权利要求3所述重组表达载体的基因工程菌。

7.根据权利要求6所述的工程菌，其特征在于所述工程菌为酵母菌，优选为毕赤酵母，更优选为毕赤酵母GS115。

8.一种利用权利要求6所述基因工程菌制备牛胰蛋白酶原突变体的方法，其特征在于包括构建该基因工程菌，筛选得到该基因工程菌，发酵培养该基因工程菌，以及收集和制备牛胰蛋白酶原突变体。

9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于发酵培养该基因工程菌所用生长碳源为甘油，诱导碳源为甲醇。

10.根据权利要求8所述的方法，其特征在于包括如下步骤：

1.将权利要求1所述牛胰蛋白酶原突变体基因与质粒构成重组表达载体，并连接到含有对应筛选标记的酵母表达载体中，并将重组载体转化至对应酵母宿主中；

2.诱导上述酵母宿主表达牛胰蛋白酶原突变体：

3.通过肠激酶处理上述牛胰蛋白酶原，生成牛胰蛋白酶；

4.纯化上述牛胰蛋白酶。