[发明专利]一种牛支原体药敏快速检测试剂盒及其制备方法

说明书

本发明涉及体外诊断试剂及制备方法，具体涉及一种牛支原体药敏快速检测试剂盒及其制备方法。本发明提供了一种牛支原体药敏快速检测试剂盒，所述试剂盒包括牛支原体培养液、药敏板和抗生素药物。所述牛支原体培养液包括以下成分及含量：PPLO粉10～15g，短肽2～4g，莫诺苷100～500mg，酵母粉2～6g，葡萄糖1～3g，丙酮酸钠1.5～4.5g，MEM培养基80～120mL，1％(w/v)酚红溶液2mL，马血清100～300mL，30万单位青霉素和ddH₂O 700～800mL。本发明培养液能快速促进牛支原体生长，20‑24h内即可完成检测，且性能稳定，特异性强。

技术领域

本发明涉及体外诊断试剂及制备方法，具体涉及一种牛支原体药敏快速检测试剂盒及其制备方法。

背景技术

牛支原体(mycoplasma bovis)是引起成母牛乳腺炎、犊牛肺炎和关节炎的重要病原之一，有较强的传染性，并常与其他病原菌混合感染，严重威胁牛群健康，给养牛业造成了巨大的经济损失。牛支原体在1961年首次于患有乳腺炎牛的牛乳中分离得到，我国自2008年首次报道了牛支原体肺炎之后，不断有各地牛场发生犊牛支原体肺炎死亡和成母牛支原体乳腺炎的病例。该病发病率高，犊牛治疗不当或造成死亡，常与其他细菌或病毒混合感染时临床症状复杂多样，故仅通过临床症状和用药情况，不能准确判断是否发生支原体感染。另外，由于支原体没有细胞壁，多数抗生素对牛支原体无治疗效果，牧场长期不规范用药也使得少数有效抗生素也存在耐药菌株。即使确定为支原体感染，也不能盲目用药，合理的药敏试验是指导临床用药的重要参考依据。然而，目前在牛支原体药敏试验方面，尚没有国家标准或专利可以参考，还未有商品化试剂盒。

发明内容

本发明主要目的是提供一种牛支原体药敏快速检测试剂盒，帮助疾控部门和牛场及时发现支原体感染，制定有效治疗方案，提升病牛治愈率，减少经济损失。

为实现上述目的，本发明通过以下技术方案实现：

第一个方面，本发明提供一种牛支原体药敏快速检测试剂盒，所述试剂盒包括牛支原体培养液、药敏板和抗生素药物。

第二个方面，本发明提供一种所述牛支原体药敏快速检测试剂盒的制备方法，包括下述步骤：

(1)牛支原体培养液的制备：将PPLO粉12g，短肽3g，莫诺苷300mg，酵母粉4g，葡萄糖2.5g，丙酮酸钠3.5g，溶于750mL ddH₂O中，加入MEM培养基100mL，1％(w/v)酚红溶液2mL，116℃灭菌20min后，加入56℃灭活的马血清150mL和30万单位青霉素，调节PH值为7.6～7.8，分装至15mL培养管，9mL/管。

(2)药敏板的制备：

S1.将96孔板经粗洗、精洗、40℃恒温烤干备用；

S2.将红霉素、氟苯尼考、诺氟沙星、卡那霉素、替米考星、泰拉霉素、加米霉素和四环素溶解到1-5mL缓冲液中，依次稀释至128μg/mL～0.125μg/mL；

S3.用加样器分别吸取各浓度药物添加到相对应的96孔板中，静置30分钟后，吸出弃去。

本发明优化了牛支原体培养液的成分和用量。短肽α-氨基酸以肽链连接在一起而形成的化合物，也是蛋白质水解的中间产物。支原体基因组小，自身合成能力较弱，本发明技术人员发现，在牛支原体培养液中加入肽链为Tyr-Leu-Tyr-Glu-Val-Ala的低聚短肽后，能快速促进牛支原体的生长。

莫诺苷(分子式：C₁₇H₂₆O₁₁，CAS号：25406-64-8)从山茱萸干燥成熟果肉中提取得到，研究表明莫诺苷具有保护细胞免于H₂O₂诱导的细胞毒性和细胞凋亡的作用。本发明技术人员发现在一定浓度范围内莫诺苷能够延长支原体稳定期，减慢了支原体凋亡的速度。