[发明专利]与草莓软化相关的氨基己糖苷酶及编码基因、制备与应用

说明书

本发明公开了两个来源于草莓(Fragaria×ananassa qing xiang)的氨基己糖苷酶基因序列及其制备方法和应用，即利用基因工程的技术方法，将该氨基己糖苷酶的基因克隆到毕赤酵母表达载体上，获得可异源表达该酶的毕赤酵母重组菌株，用该菌株异源表达制备的氨基己糖苷酶，能以p‑硝基苯基‑N‑乙酰‑β‑D‑氨基葡萄糖胺或P‑硝基苯基‑N‑乙酰‑β‑D‑氨基半乳糖胺为底物进行反应。本发明还提供了氨基己糖苷酶在控制采后果实软化及保鲜剂活性筛选方面的应用，属于果实保鲜领域。

技术领域

本发明属于果实保鲜领域，具体涉及两个与草莓软化相关的氨基己糖苷酶编码基因及其制备与应用。本发明提供了两个草莓氨基己糖苷酶的重组质粒和重组基因工程菌株，还提供了草莓氨基己糖苷酶在草莓保鲜剂筛选和糖链降解方面的应用。

背景技术

草莓属蔷薇科草莓属的多年生草本植物，是经济价值较高的小浆果，果实柔软多汁，因富含多种人体必需营养物质，在我国素有“水果皇后”的美誉。然而草莓含水量高、果皮薄，耐贮藏性差，采后极易因机械损伤和病菌侵染而腐烂变质，常温下仅可保存1-3天即失水萎缩，逐渐软化腐烂。由于草莓成熟期短,上市集中，耐贮性差,缩短了销售期及供应加工时间,限制了草莓的远销和草莓种植业规模化发展。因此,延长草莓果实的贮藏期或货架寿命,是生产中急待解决的问题。目前控制草莓采后保鲜的最有效手段是冷藏结合化学杀菌剂处理，但由于化学杀菌剂残留带来的诸多食品安全问题，迫切需要研究新型的绿色环保采后保鲜剂。然而高效的保鲜剂筛选方法的缺乏成为限制绿色环保保鲜剂开发的主要技术瓶颈。

果实采后的成熟软化作为果实一项重要的生命活动，是一个极其复杂而又受到高度调控的发育过程。大量研究表明这一过程是由内在和外部环境因素所共同决定的主动过程，因而可以通过发现控制果实采后保鲜的关键因子，建立基于这些关键因子的保鲜剂筛选方法。乙烯是调节呼吸跃变型果实成熟的重要植物激素，可以经过系列的信号传递和一定的内部机制控制果实的成熟软化。因此研究人员以是否可以将果实自身乙烯信号途径进行阻断，开发了系列乙烯阻断类保鲜剂，目前广泛应用的1-MCP，即为乙烯途径的阻断剂，能有效抑制蔬果产生的乙烯，从而大大的延长了蔬果的贮藏期，同时有效的减少了果蔬的腐烂。然而草莓属于非呼吸跃变型果实，乙烯在这类果实成熟软化过程中并不发挥关键作用，因此以乙烯途径阻断为作用靶点的保鲜剂筛选方法并不适合草莓保鲜剂的开发。

β-D-N乙酰己糖胺酶(β-N-Acetylhexosaminidase/β-hexosaminidase，β-hex)(EC3.2.1.52)属于糖苷水解酶20家族成员，水解位于N-糖蛋白非还原性末端的N-乙酰-D-己糖胺残基(N-acetylglucosamine，GlcNAc)。β-hex的酶活性在果实成熟软化过程中显著上升，这在西红柿、辣椒中都有报道。研究人员利用RNAi技术抑制了番茄和辣椒中β-hex基因的表达，结果转基因果实衰老软化速率下降，果实硬度提高了近2倍，货架期延长；而过表达该基因的果实衰老软化时间提前，软化速率加快。然而目前在草莓中β-hex的酶及编码基因还尚无报道，其在草莓软化过程中的变化规律如何尚不清楚，更没有将其应用于草莓保鲜剂筛选的相关报道。

本专利提供了两个与草莓软化相关的氨基己糖苷酶及其编码基因，基于这两种酶的基因和酶活的表达在草莓采后软化过程中的变化规律，本专利提供了一种草莓保鲜剂的筛选方法，具体是将氨基己糖苷酶的基因表达作为草莓保鲜剂的筛选指标，通过对该基因的抑制作用情况，判断化合物的保鲜作用。这是首次将氨基己糖苷酶作为调控作用靶标的，一种基于调控果实内在成熟软化机制的保鲜剂筛选方法，这种筛选方法具有针对性强、高效、安全、快捷的优势，具有很高的实用价值和应用前景，解决了现有技术中针对草莓果实的保鲜剂筛选方法缺乏的问题，对于非呼吸跃变型果实的保鲜剂筛选也具有借鉴意义。本专利同时还提供了两个草莓氨基己糖苷酶的重组质粒和重组基因工程菌株，及重组氨基己糖苷酶在糖链降解中的应用。

发明内容

本发明的第一个目的是提供两个草莓来源的氨基己糖苷酶β-hex1与β-hex2及其编码基因。