[发明专利]从复杂样本中提取并纯化沙门氏菌DNA的试剂盒及方法

权利要求书

1.一种从复杂样本中提取并纯化沙门氏菌DNA的试剂盒，其特征在于，包括：

1）偶联了噬菌体P22的gp13蛋白的羧基化纳米磁珠CPBA-MNPs；

2）样本稀释液；所述样本稀释液的组成为： NaCl 137mM, KCl 2.7mM, Na₂HPO₄ 4.3mM,KH₂PO₄ 1.4mM, 0.05％Tween-20；

3）样本裂解液；所述样本裂解液的组成为：NaCl 0.05mM, EDTA 5mM, PH=7.5的Tris-HCl 20mM, 溶菌酶 3mg/ml；

4）核酸清洗液；所述核酸清洗液的组成为：NaCl 0.05mM, EDTA 0.05mM, PH=7.5 的Tris-HCl 20mM，无水乙醇70%；

5）DNA洗脱液；所述DNA洗脱液的组成为：EDTA 5mM, PH=8.8的Tris-HCl 10mM；

6）核酸吸附磁珠。

2.如权利要求1所述从复杂样本中提取并纯化沙门氏菌DNA的试剂盒，其特征在于， 1）偶联了噬菌体P22的gp13蛋白的羧基纳米磁珠CPBA-MNPs的制备方法为：

a）采用噬菌体P22的gp13蛋白的沙门氏菌表达系统，可溶性表达gp13蛋白并纯化；

b）活化羧基化纳米磁珠；

c）噬菌体P22的gp13蛋白与羧基化纳米磁珠偶联。

3.如权利要求2所述从复杂样本中提取并纯化沙门氏菌DNA的试剂盒，其特征在于， c）噬菌体P22的gp13蛋白与羧基化纳米磁珠偶联的具体过程为：

以含有Tween-20的硼酸盐溶液为偶联缓冲液，用所述偶联缓冲液清洗羧基化纳米磁珠；

将所述羧基化纳米磁珠、纯化后的噬菌体P22的gp13蛋白以及偶联缓冲液混合，20-30℃下偶联2-4小时；磁性分离去除上清液，加入PBST溶液重悬磁珠，20-30℃反应30-90min封闭磁珠表面未反应的活化羧基基团；

磁性分离去除上清液，采用PBS或保存溶液洗涤后，置于保存溶液中，4℃保存。

4.如权利要求3所述从复杂样本中提取并纯化沙门氏菌DNA的试剂盒，其特征在于，所述偶联缓冲液的pH为7.5-8.5。

5.采用权利要求1所述试剂盒从复杂样本中提取并纯化沙门氏菌DNA的方法，其特征在于，包括步骤：

1）取复杂样本，加入所述样本稀释液，混匀后，离心取上清；

2）加入偶联了噬菌体P22的gp13蛋白的羧基化纳米磁珠CPBA-MNPs，36.5-37.5℃下振荡培养10-20min；

3）磁性分离结合了沙门氏菌的磁珠，移去液体，结合了沙门氏菌的磁珠采用样本稀释液清洗；

4）向结合了沙门氏菌的磁珠中加入样本裂解液，于36.5-37.5℃下温育15-20min，裂解菌体；

5）裂解完毕后，冷却至室温，加入核酸吸附磁珠，室温混匀；

6）吸附有核酸的磁珠采用核酸清洗液清洗；

7）向吸附有核酸的磁珠中加入DNA洗脱液，36.5-37.5℃下温育，然后磁性分离，上清液于-20℃下保存。

6.如权利要求5所述从复杂样本中提取并纯化沙门氏菌DNA的方法，其特征在于：步骤1）中，1g复杂样本中加入8-10 mL样本稀释液；步骤2）中偶联了噬菌体P22的gp13蛋白的羧基化纳米磁珠CPBA-MNPs与步骤1）上清液的体积比为1:0.6-1.5。

7.如权利要求5所述从复杂样本中提取并纯化沙门氏菌DNA的方法，其特征在于：步骤4）中，结合了沙门氏菌的磁珠与样本裂解液的体积比为1:3-5；步骤5）中，核酸吸附磁珠与结合了沙门氏菌的磁珠的体积比为2.5-3.5:2；步骤7）中，DNA洗脱液与核酸吸附磁珠的体积比为1:5-7。