[发明专利]甘赖脯胰岛素结晶的制备方法

说明书

本发明公开甘赖脯胰岛素结晶的制备方法，所述方法包括向含甘赖脯胰岛素的结晶液中以两步或更多步的方式添加Zn离子进行两步或更多步结晶，其中，以Zn与甘赖脯胰岛素的质量比计，第一步结晶时所添加的Zn离子的量为0.1％‑0.8％，其它步结晶时所添加的Zn离子的量为0.1％以上，且各步所添加的Zn离子总量为0.4％以上。该制备方法能够制备高质量和高收率的甘赖脯胰岛素结晶，易于甘赖脯胰岛素的工业化生产。

技术领域

本发明涉及人胰岛素类似物结晶的制备方法，具体地讲，涉及甘赖脯胰岛素(GlyA21-LysB28-ProB29-人胰岛素)结晶的制备方法。

背景技术

糖尿病是胰岛素分泌缺陷或作用不足导致的以高血糖为特征的代谢紊乱。据2012年11月统计，中国已经跃居成为世界上糖尿病患者人数最多的国家，我国糖尿病患病人数每小时增加400人次，每天增加1万人次，患病总数已达到9420万，患病率高达9.7％，它的危害性仅次于心脑血管疾病和肿瘤。此外，我国约有3/4的糖尿病患者患有并发症，患者的慢性高血糖状态与长期并发症显著相关，容易导致肾脏、眼、神经、心脏和血管等众多器官损害、功能障碍和功能衰竭，危害性极大。

胰岛素治疗一直被当作是治疗糖尿病并使血糖得到良好控制的重要手段。近年来，随着胰岛素技术的不断发展，人们开发出了具有不同作用时间的新一代胰岛素，即胰岛素类似物。其中一种新开发的长效胰岛素类似物—甘精胰岛素，正在越来越多被医生和患者所接受和使用。但是，甘精胰岛素在临床应用时也存在一些问题：1.起效慢(起效时间约为1.5小时)，对餐时血糖过高的患者，或偶尔进餐较多的患者无法有效降低其餐后血糖；2.不能与其他胰岛素混合使用，这是由于各种胰岛素的等电点不同，甘精胰岛素在酸性条件下稳定，而天然胰岛素及现有速效胰岛素类似物在中性条件下稳定，如果将甘精胰岛素与其他胰岛素直接混合，会导致甘精胰岛素在注射前发生沉淀而不能施用，而其他胰岛素在混合后也由于受混合物酸碱度变化的影响，稳定性降低，安全性也随即降低。因此，在甘精胰岛素的包装说明书上，生产商特别注明不要将甘精胰岛素与其他任何类型的胰岛素混合。

然而，甘赖脯胰岛素的出现解决了上述问题，甘赖脯胰岛素是一种快速起效且在酸性条件下稳定的胰岛素类似物。该胰岛素类似物的A链A21位的天冬酰胺(Asn)突变为甘氨酸(Gly)、B链B28位的脯氨酸(Pro)突变为赖氨酸(Lys)、B29位的赖氨酸(Lys)突变为脯氨酸(Pro)，其可以与长效胰岛素类似物如甘精胰岛素混合，制成同时具有速效降糖和平稳长效降糖两种功能的预混制剂，解决现有天然胰岛素(猪、牛、人)和速效胰岛素类似物在酸性环境下不稳定，以及现有胰岛素预混制剂不澄清，需引入外源蛋白(例如鱼精蛋白)作缓释剂而易产生免疫反应，每日需早、晚注射两次的问题，使制剂安全性更高。

结晶形式的甘赖脯胰岛素由于具有均一稳定的固体分子形式，并且沉降体积小，易与上清分离，离心时间及冻干时间短，生产效率高，是更好的甘赖脯胰岛素的应用形式。因此亟需将甘赖脯胰岛素制备成结晶，再应用到胰岛素制剂中。

在现有技术中有很多胰岛素的结晶方法，例如在Abel J.J,PNAS,12:132(1926)、美国专利US2920104、中国专利CN95106555.6等中所描述的那些方法。但是，甘赖脯胰岛素因其等电点为约5.3，与其他胰岛素差异较大，应用现有的胰岛素结晶方法，并不能使甘赖脯胰岛素形成结晶，只能形成无定形沉淀。，因此，亟需开发一种甘赖脯胰岛素结晶的制备方法。

发明内容

本发明的目的是解决现有上述问题，提供一种甘赖脯胰岛素结晶的制备方法，该方法可大规模地制备高质量和高收率的甘赖脯胰岛素-锌结晶。该结晶具有稳定的固体分子形式，易于大批量生产操作，沉降体积小，易与上清分离，离心时间及冻干时间短，生产效率高，与沉淀同批量的甘赖脯胰岛素沉淀相比，离心处理时间将会缩短5-6倍。

胰岛素结晶主要是通过胰岛素与锌离子结合成的六聚体按照正负离子之间的静电引力相互堆积而成。常规胰岛素在酸性条件下存在下述平衡：