[发明专利]改进的酮还原酶突变体及其制备方法和应用

说明书

本发明涉及基因工程技术领域，尤其涉及改进的酮还原酶突变体及其制备方法和应用，所述酮还原酶突变体具有(I)、(II)所示的氨基酸序列中任意一个：(I)与SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列具有至少80％同一性的氨基酸序列；(II)与SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列的12至214位氨基酸经修饰、取代、缺失或添加一个或几个氨基酸获得的氨基酸序列；所述取代为取代1‑14个氨基酸；其中，所述突变体具有酮还原酶的活性。本发明中通过设计12至214位氨基酸的多个不同位点的突变，发现这些突变体提高了酮还原酶的活性、稳定性、可溶性表达、选择性、还可以降低酮还原酶的使用量。

技术领域

本发明涉及基因工程技术领域，尤其涉及改进的酮还原酶突变体及其制备方法和应用。

背景技术

手性醇是一类非常重要的手性化合物，是合成手性药物和天然产物等的重要中间体。含手性因素的化学药物的对映体在人体内的药理活性、代谢过程及毒性存在显著的差异，当前手性药物的研究已成为国际新药研究的主要方向之一。

手性醇化合物在药物合成、农用化学品及其他精细化学品中有着重要应用，如3-氯-1-(4-氟苯基)丙-1-醇及其衍生物是合成抗抑郁药物托莫西汀、尼索西汀的重要的中间体，具有重要的应用价值。

目前合成手性醇的方法有物理法和化学法。物理法利用两种对映体的结晶速度和结晶形态不同，来对映体进行分离，但适用性极低，且产率低；化学拆分法是制备手性醇的常用方法，但需要手性试剂，理论产率仅为50％，工艺复杂，要求条件高；Pop等(Pop,LauraAncua；Czompa,Andrea；Paizs,Csaba；Toa,Monica Ioana；Vass,Elemer；Matyus,Peter；Irimie,Florin-Dan-Synthesis,2011,#18,p.2921-2928)利用脂肪酶拆分法实现手性醇的制备，获得99％ee，但产率仅为34-42％，工艺复杂，需多步骤制备手性醇，成本较高，具体步骤如下：

采用手性催化剂进行不对称氢化反应合成手性醇的应用较多，但高效的催化剂很少，且催化过程中较多的苛刻条件，有毒化学品的使用，使得手性醇的合成环境污染性较大，对人员安全存在隐患。Xu,Xianxiu等(Xu,Xianxiu；Fu,Renzhong；Chen,Jin；Chen,Shengwu；Bai,Xu-Bioorganic and Medicinal Chemistry Letters,2007,vol.17,#1,p.101-104)利用手性(R)-CBS催化不对称合成(S)-3-氯-1-(4-氟苯基)丙-1-醇，这一方法具有反应速率快，选择性好，回收方便的优点，但是原料氯甲酸乙酯为毒性物质，存在安全隐患，同时步骤较繁琐，需先经某些反应保护氨基和羧基后进行格氏反应，之后脱去保护基团得前驱体(R/S)-α，α’-二苯基-2-吡咯烷甲醇，在与硼烷或其衍生物进行反应而得到。

酮还原酶是一种普遍存在于自然界中的氧化还原酶，具有将羰基物质不对称还原成相应手性醇的能力，需要辅酶NADH或NADPH的参与，与化学方法比较就有很高的立体和化学选择性，具有安全性和环境相容性，是绿色环保的过程，一步催化到位，具有化学方法不可比拟的优势。但是野生型酮还原酶对于非天然底物，它们的反应活性差异较大，对于特定的非天然底物不反应或者反应极差。同时在稳定性及选择性上差异较大，因此限制了酮还原酶在手性醇的合成及产业化生产的应用。