[发明专利]检测SARS病毒和MERS病毒用引物探针组及试剂盒和检测方法

说明书

本公开公开了重组酶聚合酶扩增检测重症急性呼吸综合征病毒和中东呼吸综合征病毒用引物探针组和试剂盒及检测方法，包括具有SEQ ID NO.1‑4所示核苷酸序列的引物，以及，含有SEQ ID NO.5‑6所示核苷酸序列的探针。本公开还提供了一种重组酶聚合酶扩增检测重症急性呼吸综合征病毒和中东呼吸综合征病毒的试剂盒，所述试剂盒包括本公开所述的引物探针组。通过上述技术方案本公开显著地提高了对重症急性呼吸综合征病毒和中东呼吸综合征病毒检测的敏感性、特异性和简便性。

技术领域

本公开涉及生物技术领域，具体地，涉及一种检测重症急性呼吸综合征病毒(SARS-CoV)和中东呼吸综合征病毒(MERS-CoV)用引物探针组及试剂盒和检测方法。

背景技术

2003年在我国暴发的传染性非典型肺炎被世界卫生组织WHO定义为重症急性呼吸综合征(severe acute respiratory syndrome，SARS)，是一种新发传染病。其病原体为变异的冠状病毒-SARS冠状病毒(SARS Coronavirus,SARS-CoV)。2012年6月以来，在沙特和卡塔尔出现严重急性呼吸道感染病例，其病原与SARS-CoV同属于一个家族，DNA同源性70％，WHO正式命名为中东呼吸系统综合征冠状病毒(Middle East Respiratory Syndrome,MERS-CoV)。SARS-CoV和MERS-CoV同为冠状病毒亚科β属，是有包膜的单股正链RNA病毒，SARS-CoV基因组全长29.7kb，MERS-CoV基因组全长30.1kb，依次编码纤突糖蛋白(S)、小包膜糖蛋白(E)、跨膜蛋白(M)和核衣壳蛋白(N)。

目前国内外均建立了采用PCR技术对SARS和MERS进行快速检测的方法。但是常规PCR检测需要精密的仪器以及繁琐的试验程序，且耗时较长，难以满足非实验室环境下现场检测的要求。核酸恒温扩增技术(LAMP)与传统PCR相比核酸恒温扩增技术不需要昂贵的PCR仪，可在短时间内快速扩增出目的片段，具有简便、快速、灵敏等优点。但LAMP检测RNA样本需要设置单独的逆转录步骤，60-90min才可以完成反应，且对SNP识别度不够，引物结合区域单位点突变不能被LAMP识别。LAMP采用65℃恒温扩增，若待检测区域的GC含量过低、过高或者二级结构复杂，则扩增效果较差。且LAMP采用多组引物进行滚环复制，产物量巨大，极易污染实验环境，产生假阳性结果。

冠状病毒对人类健康仍然是一个重大的潜在威胁。因此建立一种快速、准确、简便、特异的SARS-CoV和MERS-CoV检测技术，对病例的快速识别和疫情的传播控制具有重要意义。

发明内容

本公开的目的是解决现有的冠状病毒检测方法中存在的上述缺陷，提供一种重症急性呼吸综合征病毒和中东呼吸综合征病毒的检测引物探针和试剂盒，并建立一种基于重组酶聚合酶扩增(Recombinase Polymerase Amplification，RPA)技术的SARS-CoV和MERS-CoV的快速、灵敏、特异，简便的检测方法。

为了实现上述目的，本公开的第一个方面提供重组酶聚合酶扩增检测重症急性呼吸综合征病毒和中东呼吸综合征病毒用引物探针组，包括具有SEQ ID NO.1-4所示核苷酸序列的引物，以及，含有SEQ ID NO.5-6所示核苷酸序列的探针；

其中，SEQ ID NO.5所示核苷酸序列中，自5’端起第30位碱基标记有FAM发光基团，第31位碱基后连接脱碱基位点，第33位碱基标记淬灭基团BHQ1；SEQ ID NO.6所示核苷酸序列中，自5’端起第31位碱基标记有CY5发光基团，第32位碱基后连接脱碱基位点，第34位碱基标记淬灭基团BHQ3。

可选的，还包括具有SEQ ID NO.7-8所示核苷酸序列的引物，以及，含有SEQ IDNO.9所示核苷酸序列的探针；其中，SEQ ID NO.9所示核苷酸序列中，自5’端起第30位碱基标记有ROX发光基团，第31位碱基后连接脱碱基位点，第33位碱基标记淬灭基团BHQ2。