[发明专利]人工抗原递呈细胞及其构建方法与在嵌合抗原受体T细胞扩增中的应用

说明书

本发明涉及一种人工抗原递呈细胞及其构建方法与在嵌合抗原受体T细胞扩增中的应用，属于医疗技术领域。本发明以K562细胞为载体，通过慢病毒转染在细胞膜表面稳定表达CD137L、CD86、CD64、膜固定白介素15和CD19，构建新型人工抗原递呈细CD137L CD86 CD64 mIL‑15 CD19‑K562细胞，以此作为扩增的饲养细胞，从外周血淋巴细胞中直接扩增CD19 CAR‑T细胞。流式细胞分选表明建立的aAPC表面分子标志构建完成。经构建的aAPC扩增的后的CD19 CAR‑T细胞增殖良好、纯度高、细胞毒性强，具有明显的肿瘤细胞杀伤效应。

技术领域

本发明属于医疗技术领域，具体涉及一种人工抗原递呈细胞及其构建方法与在嵌合抗原受体T细胞扩增中的应用。

背景技术

T淋巴细胞是肿瘤细胞的天敌，在肿瘤免疫应答中起主要作用，对肿瘤细胞有极强的杀伤作用。但是，由于肿瘤细胞长期形成的免疫逃逸机制，能使肿瘤细胞成功躲避T细胞攻击，肿瘤快速增殖。通过将识别肿瘤相关抗原的scFv和胞内信号域“免疫受体酪氨酸活化基序”在体外进行基因重组，生成重组质粒，再在体外通过转染技术转染到患者的T细胞，使患者T细胞表达肿瘤抗原受体，转染后经过纯化和大规模扩增后的T细胞，称之为嵌合抗原受体T细胞(CAR-T细胞)疗法。近年来，CAR修饰T细胞技术在白血病、淋巴瘤、黑色素瘤、脑胶质瘤等恶性肿瘤治疗中均显示出良好的抗肿瘤效应。

尽管嵌合抗原受体T细胞(CAR-T细胞)治疗具有良好的抗肿瘤效应和巨大的应用前景，但在体外经过重组的细胞毒性T淋巴细胞只是一个很小的群体，难以满足巨大的临床需要。为解决这一难题，首先要在数量上保证重组细胞毒性T淋巴细胞的有效供给，因此，探索各种有效的细胞毒性T淋巴细胞体外扩增(Exvivo expansion)方法已成为嵌合抗原受体T细胞疗法的重要发展趋势。

应用人工抗原递呈细胞(artificial antigen presenting cell，aAPC)作为饲养细胞(feeder cell)进行细胞毒性T淋巴细胞体外扩增已成为细胞毒性T淋巴细胞扩增的一种重要方法。以往有研究者应用mIL21和CD137L转化的k562细胞进行T细胞扩增，这种方法可以获得较高细胞毒性的T细胞，但是细胞增殖受到限制，2周后细胞不再增殖。因此如何克服现有技术的不足是目前医疗技术领域亟需解决的问题。

发明内容

本发明的目的是为了解决现有技术的不足，提供人工抗原递呈细胞及其构建方法与在嵌合抗原受体T细胞扩增中的应用。本发明方法构建的抗原递呈细胞，其表面携带CD137L、C D86、CD64、mIL-15和CD19这5个表面分子，有效的在体外扩增得到CD19特异性表达的T细胞，并在后期能良好的增殖，有较强的肿瘤杀伤效应，为生物治疗提供了新的方法学和物质基础。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：

一种人工抗原递呈细胞，所述人工抗原递呈细胞为CD137L CD86 CD64 mIL-15CD1 9-aAPC，其细胞膜表面稳定表达CD137L、CD86、CD64、膜固定白介素15和CD19。

进一步，优选的是，所述人工抗原递呈细胞为CD137L CD86 CD64 mIL-15 CD19-K562细胞。

本发明还提供上述人工抗原递呈细胞的构建方法，包括以下步骤：

(1)分别构建包含CD137L、CD86、CD64、mIL-15、CD19的慢病毒表达载体；

(2)将包含CD137L慢病毒表达载体转染相应的细胞，挑单细胞克隆，流式细胞分选，获得CD137L稳定表达的细胞CD137L-aAPC；

(3)在步骤(2)获得的CD137L-aAPC基础上通过包含CD86慢病毒表达载体转染来导入CD86，挑单细胞克隆，流式细胞分选，建立CD137L CD86-aAPC；