[发明专利]一种用于检测牛轮状病毒的胶体金免疫层析试纸条及其制备方法和应用

说明书

本发明公开了一种用于检测牛轮状病毒的胶体金免疫层析试纸条及其制备方法和应用。所述的试纸条包括从左到右依次连接的样品垫、胶体金垫、硝酸纤维素膜以及吸水滤纸，还包括位于下方的PVC底板，其中PVC底板的作用是提供组装平台，硝酸纤维素膜上具有山羊抗鼠IgG喷涂的质控线，以及兔抗牛轮状病毒多克隆抗体喷涂的检测线，胶体金垫上涂覆有胶体金颗粒标记的鼠抗牛轮状病毒VP6蛋白的单克隆抗体，样品垫提供了待测样品加入的位置；其中，所述的鼠抗牛轮状病毒VP6蛋白的单克隆抗体是由保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会微生物中心的，菌种保藏编号为CGMCC NO.14726的杂交瘤细胞株分泌产生。本发明制备的试纸条，灵敏度好，特异性高，操作简单、快速，适用于现地检测。

技术领域

本发明涉及一种检测牛轮状病毒的试纸条，特别涉及一种基于胶体金技术制备的用于检测牛轮状病毒的胶体金免疫层析试纸条及其制备方法和应用，本发明属于医药技术领域。

背景技术

牛轮状病毒(Bovine Rotaviens,BRV)，属于呼肠孤病毒科轮状病毒属，是引起犊牛腹泻的主要病原之一。牛轮状病毒主要感染15-45日龄犊牛，发病早期表现为精神沉郁、流涎、腹泻，若不及时治疗，病牛可发生脱水、体温下降，极易继发细菌感染，并导致死亡。给我国养牛业带来严重危害和巨大的经济损失。因此，研究与开发牛轮状病毒检测的新技术，建立敏感性强、特异性高的快速检测方法对诊断和防控牛轮状病毒病，提高我国畜牧业的整体发展水平，推动畜牧业的健康发展具有重要的实践意义。

目前，我国对牛轮状病毒病的经典检测方法是电镜技术、分离培养、免疫荧光技术、酶联免疫吸附试验(ELISA)、核酸电泳法、反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)等。电镜技术要求样品中RV达到一定数量才能检测到，并且要求具备特殊设备和专业技术人才，基层单位普及困难，应用受到限制。体外分离培养RV难度大、周期长，多数RV需要经过胰蛋白酶及胰凝乳酶等蛋白水解酶处理后才能适应细胞生长。因此，该方法局限性较大，且不利于大规模检测。免疫荧光技术、酶联免疫吸附试验(ELISA)、核酸电泳法、反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)等方法检测病原，对仪器和设备的要求较高，只适用于实验室检测，不适于现地检测。

免疫胶体金技术的应用，最早出现在1980年，用胶体金检测人绒毛膜促性腺激素(hCG)，1985便实现了商品化。胶体金技术是一种新型的免疫标记物，在各研究领域都得到了广泛应用。比如食品安全方面，检测瘦肉粉，蛋白粉，食用色素，抗生素等含量。在临床上检测病毒感染、细菌感染，为临床诊断提供了更便捷的技术。随着胶体金标记技术的发展，延伸至电镜领域，形成了胶体金免疫电镜技术，目前是最敏感的免疫组化方法。胶体金颗粒的优点在于，不染色可直接观察，与其他物质区别大，分辨率高，用于定位结果准确。对组织细胞的吸附作用小，特异性好。薛拥志等用胶体金颗粒标记新城疫病毒后通过电镜观察，与直接电镜观察病毒结果比较，发现用胶体金免疫电镜技术更容易找到病毒粒子，说明免疫金标记可以显著提高病毒检出率。胶体金探针主要用于电子显微镜的标记，当以不同的方式制备时，颗粒的密度与直径有很大的选择空间，使得它们适用于不同的试验需要。在分子水平上，金颗粒直径增大到30-100nm；在宏观层面上，这将致在含有结合金颗粒的区域形成深色染色，大大增加了可见度和对比度。近年来将金标记应用于传感器研究增多，Brainina等，Tang等，Kitano等都通过实验验证了标记特异性蛋白胶体金在生物传感器上的作用，且敏感性与稳定性都有所提高。

本发明通过获得BRV多克隆抗体和单克隆抗体腹水，结合胶体金免疫层析技术制备成胶体金免疫层析试纸条。胶体金免疫层析试纸条具有简单快速、结果清晰的特点，无需复杂的操作技巧和特殊设备，且成本低、携带方便，因此，本发明的提出为BRV的快速诊断提供了一种敏感、特异的现地检测方法，对BRV的综合防控具有重要的实践意义。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种简单快速、适用于现地检测牛轮状病毒的胶体金免疫层析试纸条及其制备方法和应用。

为了达到上述目的，本发明采用了以下技术手段：