[发明专利]一种用于检测牛轮状病毒的胶体金免疫层析试纸条及其制备方法和应用

权利要求书

1.一种用于检测牛轮状病毒的胶体金免疫层析试纸条，其特征在于所述的试纸条包括从左到右依次连接的样品垫、胶体金垫、硝酸纤维素膜以及吸水滤纸，还包括位于下方的PVC底板，其中PVC底板的作用是提供组装平台，硝酸纤维素膜上具有山羊抗鼠IgG喷涂的质控线，以及兔抗牛轮状病毒多克隆抗体喷涂的检测线，胶体金垫上涂覆有胶体金颗粒标记的鼠抗牛轮状病毒VP6蛋白的单克隆抗体，样品垫提供了待测样品加入的位置；

其中，所述的鼠抗牛轮状病毒VP6蛋白的单克隆抗体是由保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会微生物中心的，菌种保藏编号为CGMCC NO.14726的杂交瘤细胞株分泌产生。

2.如权利要求1所述的胶体金免疫层析试纸条，其特征在于，用于牛轮状病毒检测时按照以下步骤进行：

(a)在点样孔滴加测试样品200μL，反应10-15min观察结果；

(b)结果判定：

阳性结果：质控线和检测线都出现红色条带；

阴性结果：仅在质控线出现现一条红色条带；

无效结果：若质控线无条带出现，不论检测线是否出现红色条带结果均判定为无效。

3.一种制备权利要求1所述的胶体金免疫层析试纸条的方法，其特征在于，包括以下步骤：

(一)胶体金垫的制备

(1)玻璃器皿洗干净，浓H₂SO₄中浸泡24h，冲洗10次洗净残留的浓H₂SO₄，再用洗涤剂刷洗玻璃器皿，自来水冲洗10次，去离子水反复清洗5次，超纯水冲洗3-4次，烘箱干燥后，使用含5w/v％二甲基二氯硅烷的氯仿溶液硅化，然后用去离子水冲洗，干燥备用；

(2)将1g氯金酸加入硅化后的玻璃瓶中，再加入超纯水定容至100mL，用0.45μm滤器过滤除菌；取1mL配制好的1w/v％的氯金酸溶液于步骤(1)硅化处理过的锥形瓶中，加超纯水至100mL，稀释后的氯金酸溶液置于水浴锅中加热煮沸2-3min，用玻璃棒剧烈搅拌溶液的同时加入1-2ml 37℃预热的柠檬酸三钠溶液，继续煮沸5-8min后室温冷却，冷却后加入超纯水定容至100mL，用0.2mol/L的K₂CO₃溶液调节胶体金溶液pH至7.2-7.5，用0.22μm滤器过滤除菌，4℃避光保存，得到裸胶体金溶液；

(3)待标记抗体的准备

取出纯化的鼠抗牛轮状病毒VP6蛋白的单克隆抗体腹水，调整抗体浓度至1mg/mL，离心除去蛋白聚合物，调节待标记抗体溶液pH在8.5-9.0之间；

(4)取裸胶体金溶液离心，以除去溶液中形成的聚合物；调整裸胶体金溶液pH值在8.5-9.0之间，将待标记抗体溶液逐滴加入裸胶体金溶液中，加入时要边搅拌边加，1mg的抗体在4-6min内加完，然后室温静置；

(5)向步骤(4)得到的溶液中加入Tris-HC1缓冲液配制的10w/v％BSA溶液至其终浓度为1％作为稳定剂，以防止发生非特异性凝聚，室温下继续搅拌5min，室温静置15min；

(6)将步骤(5)得到的溶液1500r/min 4℃离心20min，弃掉底部聚合物杂质，用移液器轻轻吸取上清转移到另一离心管中，再以4℃10000r/min离心20-30min，得到可流动的棕红色高浓度的金标抗体；将得到的金标抗体产物用金标抗体复溶液稀释5-10倍，得到金标抗体溶液，4℃避光保存备用；

所述的金标抗体复溶液为含1w/v％BSA、15w/v％蔗糖、0.5v/v％Tween-20的0.01mol/LpH为7.2的PB溶液，4℃保存备用；

(7)先将玻璃纤维素膜浸泡在含0.1v/v％Tween-20、5w/v％蔗糖、0.1w/v％PVA、1％w/vBSA的0.01mol/L PB溶液中10-20min，置于37℃烘箱中干燥12h，然后将金标抗体溶液均匀喷洒在玻璃纤维上，在室温下烘干，得到胶体金垫；

(二)硝酸纤维素膜的制备

选择pH7.2的0.01mol/L PB溶液稀释纯化的兔抗牛轮状病毒多克隆抗体和山羊抗鼠IgG，划线后在37℃烘干箱中，烘干1-2h；将划好线的硝酸纤维素膜，浸于含有3w/v％BSA的0.01mol/L PB溶液中，37℃封闭1h后，用PBS缓冲液洗涤硝酸纤维素膜3次，每次5min，洗完膜后烘干；

(三)样品垫的制备

室温下，将样品垫浸泡在样品垫处理液中30min，然后放入37℃烘箱中烘干2-3h，用于组装试纸条；所述的样品垫处理液为含有0.05v/v％Tween-20、5w/v％蔗糖、0.5v/v％Triton X-100、0.5w/v％BSA的0.01mol/L PB溶液；

(四)试纸条的组装

按照从左到右的依次为样品垫、胶体金垫、硝酸纤维素膜以及吸水滤纸的顺序，将制备好的样品垫、胶体金垫、硝酸纤维素膜以及吸水滤纸组装到PVC底板上，即得。