[发明专利]检测志贺氏氏菌环介导恒温扩增试验引物组及其应用

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种恒温环介导试验检测志贺氏菌的引物组。

背景技术

志贺氏菌（Shigella）是一种在世界范围内广泛流行的人畜共患病的病原菌，主要引起人和动物急性肠炎。志贺氏菌是发达国家最常见的腹泻病病原菌之一，是受到高度关注的人畜共患病病原，国际兽疫组织（OIE）规定实验猴贸易必检项目。我国志贺氏菌检验当前采用的方法是传统分离培养-生化鉴定法，志贺氏菌培养过程中大量杂菌会把目的菌落覆盖，较难找出典型菌落,所以该方法检出率低，工作强度大，检出率低。随着新技术的出现，有必要开发出一套准确快速的检测方法，辅助或代替现行的志贺氏菌检测方法，以适应技术进步新要求。

环介导等温扩增（LAMP） 技术优点是一是设备简单，只需要水浴锅温育即可，不需要复杂或贵重仪器。二是快速高效，核酸扩增在l小时内即可完成。三是特异性高，要求4 种特异性引物，引物不匹配不能进行核酸扩增。四是高灵敏度，荧光PCR 的灵敏度相当，比PCR 高10～100倍。五是成本低廉，特别适合现场检疫和基层单位如防疫站检疫或养殖场检疫。LAMP技术的核心要素是引物，引物的优劣决定着各种形式LAMP试验性能，LAMP引物共有内引物对和外引物对4条，设计要求较高，要求引物组对靶DNA扩增性能好，对志贺氏菌特异性反应，还要求4条引物之间或自身不能发生退火情况发生，否则容易产生假阳性。但扩增效率高、特异性强、无假阳性LAMP引物的设计成功率不高，需要从大量的引物中去测试，最后选择出符合要求的引物组。所以志贺氏菌LAMP引物组是经过实践检验的科研成果，对志贺氏菌检验有较高的应用价值。

发明内容

本发明要解决的技术问题在于克服现有LAMP技术引物设计中存在的引物通用性和特异性不足的缺陷，充分利用目前公共数据资源中丰富的微生物基因组序列信息以及相应的序列分析工具，设计用于特异性识别志贺氏菌的引物组，并在此基础上形成高灵敏度、高特异性检测试剂盒。本发明基于GenBank数据库中的微生物基因组数据资源（截至2013年8月5日数据）进行志贺氏菌LAMP引物的设计，提供了一种快速恒温扩增检测志贺氏菌的方法、引物组及试剂盒。

本发明的一个目的在于提供2组引物，各含1对上下游内引物和1对上下游外引物，引物DNA序列信息如下：

引物组A：

上游外引物F3_A：5’-GAAGAGCATGCCAACACCT-3’(SEQ ID NO：1)；

下游外引物B3_A：5’-TCCTCACAGCTCTCAGTGG-3’(SEQ ID NO：2)；

上游内引物FIP_A：5’-CGGAATCCGGAGGTATTGCGT-TTTCCGCGTTCCTTGACC-3’(SEQ ID NO：3)；

下游内引物BIP_A：5’-CGCTGCATGGCTGGAAAAACTC-GCAGCAACAGCGAAAGACT-3’(SEQ ID NO：4)；

引物组B：

上游外引物F3_B：5’-GGTCATTTGCTGTCACTCC-3’(SEQ ID NO：5)；

下游外引物B3_B：5’-CTGGGCAGGGAAATGTTC-3’(SEQ ID NO：6)；

上游内引物FIP_B：

5’-GCTCGCAGAGAAACTTCAGCT-CGACACGCCATAGAAACG-3’(SEQ ID NO：7)；

下游内引物BIP_B：5’-TGGTCTGGAAGGCCAGGTAG-CATTGCCCGGGATAAAGTC-3’(SEQ ID NO：8)。

本发明的另一个目的在于，提供一种检测志贺氏菌的试剂盒，包括能检测志贺氏菌的基因组特异碱基序列的环介导恒温扩增试验引物组，还包括Bst DNA聚合酶缓冲液、Bst DNA聚合酶、dNTPs、MgSO₄和Betaine；

本发明的另一个目的在于，提供了一种志贺氏菌的方法，包括以下步骤：

（1）提取待测菌的基因组DNA；

（2）以提取的基因组DNA为模板，使用本发明的引物组进行环介导恒温扩增；

（3）对扩增产物进行检测，通过判断反应结果是否为阳性，确定待测样品中是否存在志贺氏菌；

其中，所述LAMP扩增的反应程序为：

（1）90~98℃热水浴0.5~3min；

（2）50℃水浴反应0.5~3min;

（3）63℃水浴反应0.5~2h；