[发明专利]检测禽流感病毒亚型H5、H7和H9的引物探针组

说明书

本公开提供了重组酶聚合酶扩增检测禽流感病毒亚型H5、H7和H9的引物探针组和试剂盒及检测方法，包括具有SEQ ID NO.1‑6所示核苷酸序列的引物，以及，含有SEQ ID NO.7‑9所示核苷酸序列的探针。本公开还提供了一种重组酶聚合酶扩增检测禽流感病毒亚型H5、H7和H9的试剂盒，所述试剂盒包括本公开所述的引物探针组。通过上述技术方案能显著地提高对三种感染人的禽流感病毒亚型检测的敏感性、特异性和简便性。

技术领域

本公开涉及生物技术领域，具体地，涉及一种检测禽流感病毒亚型H5、H7和H9的引物探针组。

背景技术

禽流感是由禽流感病毒(AIV)引起的一种禽类传染病，由于其具有众多的血清型，抗原变异性强，宿主范围广泛，亚型之间无交叉保护性，导致频繁爆发禽流感疫情，严重威胁禽类养殖业。根据表面血凝素(HA)和神经氨酸酶结构的不同，禽流感病毒分为16种HA亚型和9种NA亚型，共可产生144种不同的病毒亚型组合。其中H5、H7和H9等几个亚型对家禽最为致命，也能引起人类感染，是感冒病毒中致病性较高的亚型。H5和H7亚型的某些毒株可以造成禽类很高的发病率和死亡率，被称为高致病性禽流感(HPAI)病毒，高致病性禽流感可导致高达100％的发病率和死亡率，并可直接感染人并致人死亡。

因此建立快速、准确、简便、特异的禽流感检测和分型技术，对病例的快速识别和疫情的传播控制具有重要意义。

发明内容

本公开的目的是提供一种禽流感病毒H5、H7和H9亚型检测引物探针和试剂盒，并建立一种基于重组酶聚合酶扩增(Recombinase Polymerase Amplification，RPA)技术的禽流感病毒H5、H7和H9亚型的快速、灵敏、特异，简便的检测方法。

为了实现上述目的，本公开的第一个方面提供重组酶聚合酶扩增检测禽流感病毒亚型H5、H7和H9的引物探针组，其中，包括具有SEQ ID NO.1-6所示核苷酸序列的引物，以及，含有SEQ ID NO.7-9所示核苷酸序列的探针；

其中，SEQ ID NO.7所示核苷酸序列中，自5’端起第32位碱基标记有FAM发光基团，第33位碱基后连接脱碱基位点，第35位碱基标记淬灭基团BHQ1；SEQ ID NO.8所示核苷酸序列中，自5’端起第31位碱基标记有VIC发光基团，第32位碱基后连接脱碱基位点，第34位碱基标记淬灭基团BHQ1；SEQ ID NO.9所示核苷酸序列中，自5’端起第31位碱基标记有CY5发光基团，第32位碱基后连接脱碱基位点，第34位碱基标记淬灭基团BHQ3。

本公开的第二个方面提供一种重组酶聚合酶扩增检测禽流感病毒亚型H5、H7和H9的检测方法，其中，所述检测方法包括如下步骤：

(1)提取待测样本的总RNA；

(2)以所述总RNA为模板，并使用本公开第一个方面所述的引物探针组，进行重组酶聚合酶扩增反应；

(3)收集FAM、VIC和CY5检测通道荧光信号，得到检测结果；

a)若FAM荧光通道有扩增曲线，则判定样品中含有禽流感病毒H5亚型；

b)若VIC荧光通道有扩增曲线，则判定样品中含有禽流感病毒H7亚型；

c)若CY5荧光通道有扩增曲线，则判定样品中含有禽流感病毒H9亚型。

本公开的第三个方面提供一种重组酶聚合酶扩增检测禽流感病毒亚型H5、H7和H9的试剂盒，其中，所述试剂盒包括本公开第一个方面所述的引物探针组。

本发明的有益效果在于：

本公开建立的通过重组酶聚合酶等温扩增技术检测禽流感病毒H5亚型、H7亚型和H9亚型的检测方法，能够实现形态学、免疫学、LAMP以及单重实时荧光检测所无法完成的快速、全面、敏感、特异、自动的结果判定，达到如下的检测效果：