[发明专利]一种鲱鱼硫酸鱼精蛋白的制备方法

说明书

本发明公开了一种鲱鱼硫酸鱼精蛋白的制备方法，该方法通过以下工艺步骤：预处理、硫酸酸解提取、低温析出、凝胶过滤层析、脱水、冻干，从鲱鱼中提取纯化硫酸鱼精蛋白。本发明对硫酸鱼精蛋白的生产工艺进行不断改进，特别是对各工艺参数进行反复的实验研究，不断优化，最终确立了一套更为科学的规模化生产工艺。本发明所述的制备方法，产品质量高，所得的硫酸鱼精蛋白每mg所中和的肝素抗血凝作用高达150单位,含量高达95%以上，色谱纯度95%以上，其他各项指标均符合中国药典、美国药典、欧洲药典标准。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体地说涉及一种鲱鱼硫酸鱼精蛋白的制备方法。

背景技术

鱼精蛋白是一种多聚阳离子肽，主要存在于鸟类、鱼类和哺乳动物的精巢组织中。它是一种碱性蛋白质，与ＤＮＡ结合在一起，以核精蛋白的形式存在。鱼精蛋白的分子量较小，分子量主要在5.5到13.0kDa之间，由３０-５０个氨基酸组成。鱼精蛋白具有很好的稳定性，加热不易凝固，等电点在12-13之间。目前已经成功地从各种海水鱼、淡水鱼和哺乳动物成熟精巢组织中提取出鱼精蛋白。

自1937 年McClean等报道了鱼精蛋白具有抑菌活性以来，作为化学防腐剂的替代品逐渐出现在食品添加剂行列。如今，鱼精蛋白在食品工业中得到了越来越广泛的应用。与化学合成防腐剂相比，鱼精蛋白具有安全性高、防腐性能好、热稳定性高等优点，而且鱼精蛋白还具有很高的营养性和功能性，能降血压、助呼吸、促消化、抑肿瘤、抗血栓、强化肝功能、抑制血液凝固等。在医学领域里，鱼精蛋白也得到了广泛应用，它可延迟或阻止胰岛素释放，或作为肝素解毒剂等。

目前鱼精蛋白的提取, 从溶剂的采用上, 基本上是以硫酸或盐酸为主要提取剂,以柠檬酸盐或有机溶剂为纯化剂进行纯化, 也有在硫酸或盐酸抽出液中不用有机溶剂而用聚磷酸盐, 使鱼精蛋白以磷酸盐形式沉淀出来, 然后溶解在高浓度的硫酸按中, 复分解为精蛋白硫酸盐。此外, 还可采用有机溶剂( 丙酮、乙醇、氯仿等) 进行反复脱水、脱脂、抽提、洗涤鱼精蛋白,其间辅以硫酸钠、氨水、过氧化氢、EDTA 二钠盐等试剂。

但上述方法提取的硫酸鱼精蛋白含非功能性杂蛋白较多，各国药典对硫酸鱼精蛋白的纯度方面都都有较高要求，尤其美国药典在硫酸鱼精蛋白的含量、生物效价、残留溶剂、色谱纯度、元素杂质、铁含量、甲基汞含量等方面都做出了要求。因此，如何对鱼精蛋白进行纯化，成为目前鱼精蛋白纯化中亟待解决的问题。

发明内容

本发明提供了一种从鲱鱼中提取硫酸鱼精蛋白的方法，主要解决现有技术中鱼精蛋白纯度低的问题。

为了实现上述发明目的，本发明公开了一种硫酸鱼精蛋白的纯化工艺，包括以下步骤：

（1）预处理：取冷冻的鲱鱼鱼白解冻，按鱼白与纯化水的质量比为 (1～5)：1的比例加入冷水后置于组织捣碎机中捣碎，用四层纱布过滤得浆液；

（2）硫酸酸解：向上述浆液中加入0.3%～1.0%硫酸溶液，浆液与体积比为1: (5～15),酸解1~3h,5100хg离心20~30分钟；收集上清液，用30%~40%NaOH溶液调节pH至8~10,5100хg离心20~30分钟；

（3）低温析出：收集上清液，0~4℃，静置12~16h，倾去上层清液，向下层沉淀物按1：（3~10）（w/v）的比例加入50~70℃的水溶解；

（4）凝胶过滤层析：将上述溶液上样于Sephadex G-25 凝胶柱，用pH 7.0～9.0 含0.01～0.20mol/L KCl 的Tris-HCl 缓冲液平衡，紫外检测仪检测并记录，洗脱酶活性峰；

（5）脱水：固体用无水乙醇脱水两次，离心，弃去上清液，留取沉淀物；

（6）冻干：将上述沉淀物装入盘进冻干机，冻干即得硫酸鱼精蛋白