[发明专利]一种酶法转化生产9α-羟基雄甾-4-烯-3;17-二酮的方法

说明书

本发明公开了一种酶法转化生产9α‑羟基雄甾‑4‑烯‑3,17‑二酮的方法，属于基因工程和酶工程领域。本发明将来源于Mycobacterium sp.Strain VKMAc‑1817D的3‑甾酮9α‑羟基化酶的氧化亚基KshA，还原亚基KshB，及未知活性亚基KshC成功在E.coliBL21中表达，并鉴定出KshC为氧化亚基，且酶活远高于KshA。利用本实验室已构建的BL21/pET‑28a(+)‑fdh表达甲酸脱氢酶FDH，以KSH(KshB+KshC)和FDH工程菌的粗酶液作为生物催化剂，以甾体化合物AD为底物，同时确定了最佳反应温度为30℃，pH7.0。在最优条件下转化AD生成产物9‑OH‑AD，在20小时内，9‑OH‑AD的产量为4.7g/L，摩尔转化率达到96.7％。本发明产生9‑OH‑AD实现了3‑甾酮9α‑羟基化酶羟化系统与辅酶循环体系的偶联，具有效率高，成本低，绿色环保等优点。

技术领域

本发明涉及一种酶法转化生产9α-羟基雄甾-4-烯-3,17-二酮的方法，属于基因工程和酶工程领域。

背景技术

甾体化合物是广泛存在于生物体组织内的一类重要的天然有机化合物，由于甾体类药物具有多种生理功能并发挥独特疗效，故在临床上有广泛的应用，是仅次于抗生素的第二大类药物，年增长率在15％以上。甾类化合物通常具有一系列独特的生理功能，这主要是由于甾体化合物母核上取代基、双键位置或立体构型的不同。甾类化合物拥有类似的结构且结构复杂数目繁多，普遍存在于动、植物组织和某些微生物中，比较常见的有动物组织中的胆固醇、胆酸、性激素、肾上腺皮质激素、孕酮和雄酮等植物中的薯预皂素和谷甾醇等以及酵母细胞中的麦角固醇等。

9α-羟基雄甾-4-烯-3,17-二酮(9α-OH-AD)化学结构上9-羟基的存在，可借助常规甾体化学合成手段形成C9，11-双键体系，从而很方便地在C9位引入一个卤素原子形成糖皮质激素必不可缺少的功能羟基。9α-OH-AD是一种重要的甾体药物中间体，其9α位作为被羟基化的位点，在进行简单的卤化反应后便可引入F或Cl等卤素取代基，从而有效提升某些皮质类激素(如地塞米松、倍他米松、糠酸莫米松及氯地米松等药物)的药效，工艺流程的实现可根本解决目前工业生产中存在的C11α-羟基化转化率低、副产物多的问题，具有极高的商业价值。

3-甾酮9α-羟基化酶(3-ketosteroid-9-alpha-hydroxylase(KSH))是甾体微生物代谢的一个关键酶，该酶在微生物中广泛存在，例如红球菌属Rhodococcus，诺卡氏菌属Nocardia，节杆菌属Arthrobacter，分枝杆菌属Mycobacteriu。3-甾酮9α-羟基化酶系统是一个双组分酶，由KshA(3-甾酮9α-羟基化酶氧化酶)和KshB(3-甾酮9α-羟基化酶还原酶)组成，由基因kshA和kshB分别编码KshA和KshB，这一点最早在Rhodococcus erythropolisSQ1中获得证实，且对Rhodococcus erythropolis SQ1所进行的基因敲除研究表明，kshA和kshB都是KSH表达所必需的组分。KshB是3-甾酮9α-羟基化酶系统的还原组件，它负责将来自NADH的还原力传递给KshA，使其从氧化态重新回到还原态并不断地在甾体的相应位置产生羟基化反应，另外，KshB是一个多功能酶，它不仅仅在3-甾酮9α-羟基化酶系统中发挥作用，在生物体内其他需要还原力的地方也发挥着重要的作用。

甲酸脱氢酶(FDH)能催化甲酸分解生成CO₂，同时将NAD⁺还原生成NADH，可与3-甾酮9α-羟基化酶系统结合。大量研究表明，FDH是最好的NADH再生酶，在手性化合物的合成中具有独特的优势：(1)FDH催化的反应不可逆，主反应产物回收率可达99％以上；(2)底物甲酸根离子较廉价，产物CO₂易从体系中逃逸，简化分离纯化步骤；(3)FDH在较宽的耐受性，此反应只产生一种副产物-CO₂，而CO₂对任何酶的活性均没有任何影响，且反应完全，同时CO₂作为一种气体，很容易从反应体系中逃逸出来。

发明内容