[发明专利]一种基于CRISPR-Cas13a的抑制真核细胞中基因表达水平的方法及其应用

说明书

涉及基因工程领域，具体公开了一种基于CRISPR‑Cas13a的抑制真核细胞中基因表达水平的方法及其应用。通过设计并合成与目的基因mRNA中某段序列互补的向导RNA，与Cas13a蛋白形成Cas13a‑向导RNA复合物；在真核细胞中，该复合物在向导RNA的引导下，与序列互补的目的基因mRNA结合并激活Cas13a蛋白的RNA降解活性，从而引起目的基因mRNA的降解和表达水平抑制。另外，通过向导RNA的位置筛选，以及人为添加错配的方式，该方法可以高效并特异性抑制单碱基突变的癌基因表达水平，同时不影响野生型基因表达。通过向导RNA设计，本方法可用于真核细胞中的基因表达沉默以及单碱基突变的癌基因表达特异性抑制，具有特异性高、稳定准确、简便快速的特点。

方法领域

本发明涉及基因工程领域，具体地说，涉及一种基于CRISPR-Cas13a的抑制真核细胞中基因表达水平的方法及其应用。

背景方法

随着医学发展，人们逐渐认识到基因的异常表达或突变是许多疾病发生发展的关键，特别是在恶性肿瘤中，存在大量的癌基因突变，其中数量最多的就是单碱基突变。针对某些突变致病基因，人们可以设计合成出小分子抑制剂，特异性地抑制这些突变蛋白的功能；然而，仍有一些突变基因在蛋白水平上，缺乏可以设计抑制剂的位点，因此，在基因表达水平进行特异性抑制是目前医学发展中的一个关键问题。

目前，最主流的基因表达抑制工具仍是已经发展了20年左右的RNA干扰技术。RNA干扰(RNA interference，RNAi)，又称转录后基因沉默(post-transcriptional genesilencing，PTGS)，是指将特异性同源双链RNA(dsRNA)导入到细胞内，使目的基因不表达或表达水平下降。但是这种技术在特异性上存在不足之处，具有明显的脱靶效应，而且无法识别单碱基突变的癌基因，因此亟待开发出新的基因表达抑制技术。

1987年，科学家在细菌的基因组中发现了一些成簇的规律间隔的短回文重复序列(CRISPR)；随后又在这些重复序列的附近发现了CRISPR相关蛋白(Cas)的基因。随着基因组学和生物信息学的发展，科学家注意到这些CRISPR序列与许多病毒或噬菌体的DNA序列是互补的，人们逐渐认识到Cas蛋白可以在这些CRISPR序列的帮助下，对这些互补的基因序列进行切割破坏，这些结果表明CRISPR-Cas系统是原核生物进化出的专门应对病毒等外来入侵者的特异性防御机制。随着大量不同的CRISPR-Cas系统被发现出来，根据最终基因切割效应复合物的组成结构，人们将CRISPR-Cas系统分为2个家族，第一个家族包括1型和3型Cas，其切割效应复合物需要多种Cas蛋白参与组成；第二个家族包括2型Cas，其效应复合物只需要一个Cas蛋白组成，因此受到更多的关注。对于2型Cas来说，仅仅需要一个Cas蛋白和一段向导RNA，就可以对靶向基因序列进行精确切割和编辑。

目前，2型Cas主要包括Cas9、Cas12a(也成为Cpf1)、Cas13a(曾被称为C2c2)。与Cas9和Cas12a以DNA为靶向核酸不同，Cas13a是以RNA为靶向核酸序列。

发明内容

本发明的目的是提供一种基于CRISPR-Cas13a的抑制真核细胞中基因表达水平的方法。通过设计并合成与目的基因mRNA中某段序列互补的向导RNA，与Cas13a蛋白形成Cas13a-向导RNA复合物；在真核细胞中，该复合物在向导RNA的引导下，与序列互补的目的基因mRNA结合并激活Cas13a蛋白的RNA降解活性，从而引起目的基因mRNA的降解和表达水平抑制。另外，通过向导RNA的位置筛选，以及人为添加错配的方式，该技术可以高效并特异性抑制单碱基突变的癌基因表达水平，同时不影响野生型基因表达。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

一、基于CRISPR-Cas13a的抑制真核细胞中基因表达水平的方法。

该方法最终发挥基因表达抑制功能的效应器是Cas13a-向导RNA复合物。