[发明专利]一种基于CRISPR-Cas13a的抑制真核细胞中基因表达水平的方法及其应用

权利要求书

1.CRISPR-Cas13a系统在制备癌基因表达水平抑制剂中的应用，其特征在于，通过设计并合成与目的基因mRNA中某段序列互补的向导RNA，与Cas13a蛋白形成Cas13a-向导RNA复合物；在真核细胞中，该复合物在向导RNA的引导下，与序列互补的目的基因mRNA结合并激活Cas13a蛋白的RNA降解活性，从而引起目的基因mRNA的降解和表达水平抑制；

通过向导RNA的位置筛选，以及人为添加1-2个与突变位点不同的错配碱基，该方法可以高效并特异性抑制单碱基突变的癌基因表达水平，同时不影响野生型基因表达。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所用Cas13a蛋白来自细菌Leptotrichiashahii、Leptotrichia buccalis或Leptotrichia wadei。

3.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于，所用向导RNA包括锚定序列以及与目的基因互补的向导序列，其中锚定序列与Cas13a蛋白的菌属来源有关，向导序列与目的基因mRNA中某段序列互补，长度为20-28个碱基。

4.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于，Cas13a-向导RNA复合物可以通过蛋白纯化和体外转录的方式，提前形成后转染进入真核细胞；也可以通过外源基因质粒导入的方式，在真核细胞内实现外源性Cas13a和向导RNA表达后，直接在细胞内形成Cas13a-向导RNA复合物。

5.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于，在进行向导RNA的位置筛选时，向导RNA中的向导序列应覆盖单碱基突变位点，最多有28个位置选择；不同位置的向导RNA的抑制基因表达水平不同。

6.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于，人为添加的错配位点应与单碱基突变位点不同，添加错配为1-2个，从而使向导RNA中向导序列与野生型基因的错配数量为2-3个，其中包括1-2个人为添加错配和1个单碱基突变，实现Cas13a-向导RNA复合物仅能特异性抑制单碱基突变的癌基因表达，同时不影响野生型基因表达。