[发明专利]基因目标区域富集方法及建库试剂盒

说明书

本发明涉及基因目标区域富集方法及建库试剂盒。本发明的方法通过单引物线性扩增的方式，利用高保真DNA聚合酶的保真性，实现对基因目标区域的富集。本发明的方法可以高效、准确地富集目的基因，显著地减低文库构建时产生的测序错误。

技术领域

本发明属于分子生物学技术领域，具体而言，本发明涉及一种主要用于二代测序的基因目标区域富集方法及建库试剂盒。

背景技术

2016年《CA：临床医师癌症杂志》(CA Cancer J Clin)发表的中国国家癌症中心公布的2015年癌症数据显示，2015年中国新发癌症数量约为429万，癌症已成为中国首要杀手。20世纪前，临床上对于肿瘤患者除了手术、化疗、放疗外没有其他有效的治疗手段，随着人类基因组计划的完成，科技工作者们对肿瘤的研究进入到了基因序列层面，并首先在肺癌这一肿瘤类型中发现了治疗的靶点——EGFR(肿瘤表皮生长因子受体)突变，并开发出了靶向药物易瑞沙，开创一种新的靶向治疗模式。靶向治疗的前提是需要对患者进行基因状态的筛查，以前的检测手段包括实时荧光定量PCR、一代测序等，这些手段在一定程度上解决了临床上的需求，但是随着科学的发展，我们意识到在肿瘤组织本身即是个小的生态系统，其组织内部存在异质性，并且EGFR靶向药物对于携带有KRAS基因突变的患者的疗效就很差，因此对于单基因的检测并不能满足临床上的需要。21世纪初二代测序技术逐渐成熟，成本已降低至1000美元完成一个基因组的测序，加上其在检测通量上优势，二代测序技术越来越多的被用于临床检测中。

尽管全基因组测序成本在不断降低，但是对于某些检测到的突变位点，在临床上仍无法判断该突变是否与肿瘤相关、是否可以指导用药。目标区域测序又被称为靶向测序，是目前临床上通常使用的策略，这种方法通常聚焦于先前已知的某些与肿瘤发生发展或用药指导相关的基因进行测序，在降低测序成本的同时，提高了临床应用的便利性。目标区域测序的核心是将感兴趣的基因进行富集并测序，已有的两种富集方法包括多重PCR法和杂交捕获法。多重PCR法以Life Technologies公司的Ampliseq方法为代表，针对每个位点设计一对PCR引物，利用多重PCR的方法对感兴趣的基因或位点进行富集。该方法对起始DNA样本量要求低，操作相对简单，但是对于长度较短的DNA(例如血浆游离DNA、FFPE组织样本DNA等)来说，其在引物设计上有很大困难，且该方法在PCR扩增不同基因时容易出现偏好性。杂交捕获的方法通常是针对目标基因设计约120个碱基长度的探针，在固相载体上或液相中对感兴趣的基因进行杂交富集，该方法可以在DNA层面检测常见的点突变、插入突变、微缺失突变以及已知和未知的融合突变。为了有效富集，杂交捕获法需要大量的长链探针和较长的杂交周期(通常大于24小时)，由于杂交效率低，所以需要大量的DNA模板。

因此，本领域还需要改进方法，以更便捷的方法实现更高效的基因目标区域富集。

发明内容

本发明的目的在于提供基因目标区域富集方法及建库试剂盒。

在本发明的第一方面，提供一种进行目标区域富集的方法，所述方法包括：

(1)在包含待富集目标区域的DNA片段上连接测序接头1，其是能形成部分双链结构的DNA，获得连接产物；

(2)在(1)的连接产物中加入特异性探针，并加入DNA聚合酶，在探针与连接产物构成互补的基础上进行序列延伸，获得延伸产物；其中，所述的特异性探针包括测序接头2以及与包含待富集目标区域的DNA片段互补的序列；

(3)以DNA聚合酶对(2)的延伸产物进行PCR扩增，获得含有富集目标区域的DNA的扩增产物。

在一个优选例中，所述的目标区域富集的方法应用于高通量测序中。

在另一优选例中，所述的目标区域包括：序列发生变异的位点，例如：SNP突变位点区域，碱基缺失位点区域，碱基插入位点区域和融合突变位点区域等。

在另一优选例中，所述的DNA聚合酶为高保真DNA聚合酶。