[发明专利]同时检测七种水仙RNA病毒的多重RT-PCR检测试剂盒及其检测方法

说明书

本发明公开了同时检测七种水仙RNA病毒的多重RT‑PCR检测试剂盒及其检测方法。本发明的试剂盒可专用于同时检测水仙黄条病毒、水仙退化病毒、水仙潜隐病毒、南芥菜花叶病毒、水仙普通潜隐病毒、水仙花叶病毒和尼润潜隐病毒，该试剂盒包括多重RT‑PCR特异性引物、随机引物、RT Buffer、RNA酶抑制因子、反转录酶、Taq PCR Mix、阳性及阴性对照品。通过实验证明：本发明的特异性引物不仅具有特异性好、灵敏度高、高通量和结果准确的优点，而且检测方法操作简便，无需克隆、测序和序列比对的步骤，显著提高了检测效率，节约了检测时间和成本，可以有效用于七种水仙RNA病毒的快速、准确鉴定，应用前景广泛。

技术领域

本发明涉及同时检测七种水仙RNA病毒的多重RT-PCR检测试剂盒及其检测方法，属于植物检疫技术领域，适用于进出境口岸检疫和农业生产上水仙主要RNA病毒的快速检测。

背景技术

水仙(Narcissus tazetta L.)属于石蒜科(Amaryllidaceae)水仙属(Narcissus)多年生草本植物，是世界著名的观赏球根花卉。水仙作为我国传统出口名花，同时也是福建省省花，在我国花卉生产中占据着十分重要的地位。病毒病是水仙上的主要病害，引起种球变小、花箭减小、香气变淡、鳞茎退化和植株矮化等一系列症状，造成水仙的产量和品质严重下降。目前，国内外已报道可侵染水仙的主要RNA病毒包括水仙黄条病毒(Narcissusyellow stripe virus，NYSV)、水仙退化病毒(Narcissus degeneration virus，NDV)、水仙潜隐病毒(Narcissus latent virus，NLV)、南芥菜花叶病毒(Arabis mosaic virus，ArMV)、水仙普通潜隐病毒(Narcissus common latent virus，NCLV)、水仙花叶病毒(Narcissus mosaic virus，NMV)和尼润潜隐病毒(Nerine latent virus，NeLV)。由于水仙绝大多数以无性方式繁殖，一旦种球带毒，病毒将在种球内不断积累，导致种球退化，并通过子代进一步传播和扩散，成为远距离和大范围传播的重要途径。

水仙病毒病的防治极其困难，至今尚无完全有效的方法。加强病毒的早期检测，及时采取防控措施，仍是预防与控制水仙病毒病的重要手段。目前已报道的水仙病毒检测方法包括生物学测定、电镜观察、血清学检测和分子生物学检测方法四种，主要是针对单个病毒或2-3个病毒进行检测，无法对水仙上需要关注的七种主要RNA病毒(水仙黄条病毒、水仙退化病毒、水仙潜隐病毒、南芥菜花叶病毒、水仙普通潜隐病毒、水仙花叶病毒和尼润潜隐病毒)进行一次性同时检测。建立用于水仙上七种主要RNA病毒的高通量分子生物学检测方法，将极大地提高检测效率，节约检测成本。关于同时检测水仙上七种主要RNA病毒水仙黄条病毒、水仙退化病毒、水仙潜隐病毒、南芥菜花叶病毒、水仙普通潜隐病毒、水仙花叶病毒和尼润潜隐病毒的方法至今尚未见报道，更未见专门的七重RT-PCR检测试剂盒。

发明内容

本发明要解决的技术问题是如何同时检测如下七种水仙RNA病毒：水仙黄条病毒、水仙退化病毒、水仙潜隐病毒、南芥菜花叶病毒、水仙普通潜隐病毒、水仙花叶病毒和/或尼润潜隐病毒。

为了解决上述技术问题，本发明首先提供了用于鉴定七种水仙RNA病毒的成套引物对。

本发明提供的用于鉴定七种水仙RNA病毒的成套引物对由用于鉴定水仙黄条病毒的特异引物对A、用于鉴定水仙退化病毒的特异引物对B、用于鉴定水仙潜隐病毒的特异引物对C、用于鉴定南芥菜花叶病毒的特异引物对D、用于鉴定水仙普通潜隐病毒的特异引物对E、用于鉴定水仙花叶病毒的特异引物对F和用于鉴定尼润潜隐病毒的特异引物对G组成；

所述特异引物对A由引物NYSV-F和引物NYSV-R组成；

所述特异引物对B由引物NDV-F和引物NDV-R组成；

所述特异引物对C由引物NLV-F和引物NLV-R组成；