[发明专利]α-酮戊二酸依赖型酶的酶活检测试剂盒及其应用

说明书

本发明公开α‑酮戊二酸依赖型酶的酶活检测试剂盒及其应用，所述试剂盒包括还原型辅酶Ⅱ(NADPH)或者还原型辅酶Ⅰ(NADH)中的一种，异柠檬酸脱氢酶IDH突变体蛋白和缓冲盐，所述IDH突变体蛋白是指IDH特定氨基酸突变后所获得的具有催化α‑酮戊二酸(2‑OG)新功能的IDH突变体蛋白。作为一个优选方案，所述试剂盒还包括竞争亚铁离子的金属离子。本发明提供了一种高效率高精确度检测α‑酮戊二酸含量的方法，可用于检测α‑酮戊二酸依赖型酶的酶催化活性，测定其酶动力学参数，及针对该类型酶展开高通量药物筛选。该方法解决了α‑酮戊二酸依赖型酶的酶活检测操作繁琐，准确度和可重复性差，通量低，难以进行高通量药物筛选等诸多问题。

技术领域

本发明属于生物技术检测领域，更具体地讲，涉及α-酮戊二酸依赖型酶的酶活检测试剂盒及其应用。

背景技术

α-酮戊二酸是三羧酸循环中重要的代谢中间产物，是连接细胞内碳-氮代谢的关键节点。在该循环中，异柠檬酸脱氢酶(IDH)催化异柠檬酸生成α-酮戊二酸(2-OG)，而α-酮戊二酸又在α-酮戊二酸脱氢酶(OGDC)的催化下生成琥珀酰辅酶A参与下游代谢。除了作为参与三羧酸循环的重要代谢产物，α-酮戊二酸作为关键辅助因子还参与了大量重要的酶催化反应。其中，最具代表性的是亚铁和α-酮戊二酸依赖型的双加氧酶家族。该家族属于非血红素铁蛋白，广泛分布于生物体内，是参与包括蛋白、脂类、寡核苷酸等在内的生物大分子底物氧化反应的一类重要酶。目前，最具代表性的亚铁和α-酮戊二酸依赖型双加氧酶包括氧化核酸修饰底物的TET蛋白家族(DNA甲基化修饰)、AlkB蛋白家族(DNA和RNA上多种修饰)、FTO(RNA甲基化修饰)；以及氧化蛋白修饰底物的组蛋白去甲基化酶KDM家族(组蛋白甲基化修饰)、脯氨酰羟化酶PHD家族等等。这些亚铁和α-酮戊二酸依赖型的双加氧酶通常结合亚铁离子和α-酮戊二酸作为辅助因子，并在其帮助下将氧气提供的一个氧原子催化进入底物生成氧化产物，另一个氧原子则参与α-酮戊二酸脱羧反应生成琥珀酸。

由于该类酶的底物和产物多为生物大分子，且没有显著的荧光变化或其他可用于检测的物质改变，难以高效的通过检测底物的减少或产物的生成来检测酶活性、测定酶动力学参数，也无法建立高通量药物筛选体系来对这类酶进行高通量药物筛选。

目前，对于亚铁和α-酮戊二酸依赖型双加氧酶的活性检测，主要分为对生物大分子的催化产物的检测以及对α-酮戊二酸的反应产物琥珀酸的检测两大类。对于前面一类检测方法，主要检测方法为同位素标记，质谱，核磁共振等。这类方法操作繁琐，通量低，耗时长，可重复性差，对仪器的配置要求高，耗费高。对于第二类检测方法，目前已报道的有以下两种：

(1)方法一：通过与琥珀酰辅酶A合成酶-丙酮酸激酶-乳酸脱氢酶串联偶联反应，实现对α-酮戊二酸的反应产物琥珀酸的检测，从而间接检测双加氧酶的酶活。

①依赖亚铁和α-酮戊二酸的双加氧酶反应过程中实现将α-酮戊二酸催化生成琥珀酸；

②琥珀酸进一步被琥珀酰辅酶A合成酶(SCS)催化生成琥珀酰辅酶A及副产物ADP；

③副产物ADP进一步参与丙酮酸激酶(PK)催化磷酸烯醇式丙酮酸(PEP)的反应，并催化生成丙酮酸、ATP和磷酸；

④反应产物丙酮酸和ATP在乳酸脱氢酶(LDH)的作用下生成乳酸，该反应中伴随着NADH到NAD的催化。通过检测NADH在340nm下吸收值的变化，可以实现第一步双加氧酶活性的检测。

但是，由于该方法共需涉及4步酶学级联反应，反应体系中所涉及的反应底物和辅助因子较多，操作繁琐，参数设置复杂，耗时长，可重复性差，耗费高。另外使用该方法进行高通量药物筛选会导致大量假阳性和假阴性结果。

(2)方法二：通过与琥珀酰辅酶A合成酶串联级联反应，并使用孔雀绿染料检测琥珀酰辅酶A合成酶催化琥珀酸过程中的副产物磷酸来间接检测双加氧酶的酶活性。