[发明专利]化学发光增强液和化学发光底物及其应用

说明书

本发明提供用于检测样品中待测物的化学发光增强液、化学发光底物、检测方法和试剂盒，其改进之处均在于组合使用两种化学发光增强剂：邻苯基苯酚和4‑咪唑苯酚。这两种增强剂发挥协同增强效应，显著降低本底信号，而且也能让鲁米诺发光信号在较长时间内保持稳定。本发明所述检测方法和试剂盒可与化学发光分析仪配套使用，可用于肿瘤标记物、传染病、激素类及其他酶免促疫化学发光类产品的检测。

技术领域

本发明涉及用于检测样品中待测物的化学发光增强液、化学发光底物、检测方法和试剂盒，均涉及组合使用邻苯基苯酚和4-咪唑苯酚这两种化学发光增强剂，属于免疫技术领域。

背景技术

自从化学发光免疫分析法(chemiluminesent immunoassay,CLIA)于上个世纪七八十年代问世以来，因其采用非放射性标记，且将抗原抗体免疫反应和化学发光信号相结合，因而具有优良的特异性和显著提高的灵敏度，在药物分析、环境分析、食品分析和生物医学等领域都得到了广泛的应用，如在生物医学领域中用于检测肿瘤类生物标志物，如甲胎蛋白(AFP)、癌胚抗原(CEA)、铁蛋白、前列腺特异抗原(PSA)、神经元特异性烯醇化酶(NSE)、CYFRA21-1、CA19-9、CA50、CA125、CA153、CA724等；性腺类生物标志物，如促卵泡激素(FSH)、促黄体生成素(LH)、催乳素、孕酮、睾酮、雌二醇、雌三醇、β-绒毛膜促性腺激素(β-HCG)；甲功类生物标志物，如总三碘甲腺原氨酸(TT3)、总甲状腺素(TT4)、游离三碘甲腺原氨酸(FT3)、游离甲状腺素(FT4)、促甲状腺激素(TSH)、甲状腺球蛋白、甲状腺球蛋白抗体和甲状腺过氧化物酶抗体等；传染病类生物标志物，如乙肝五项(HBsAg、抗-HBs、抗-HBc、HBeAg、抗-HBe)、HCV抗原、HCV抗体、梅毒螺旋体抗原、梅毒螺旋体抗体、TORCH IgG/IgM、HIV抗原/抗体等；糖尿病类生物标志物，如胰岛素、C-肽、胰岛素自身抗体、胰岛细胞抗体、谷氨酸脱羧酶抗体；肝纤堆化类生物标志物，如层粘连蛋白、透明质酸、IV型胶原和Ⅲ型前胶原N端肽等。

目前，在市场产品中主要利用的CLIA技术可分为三大类：(1)酶促化学发光免疫分析法，化学发光底物经酶的降解作用而发光，根据酶类型不同，主要分为：a)辣根过氧化物酶(HRP)化学发光免疫分析法，其常用的化学发光底物可选自鲁米诺、异鲁米诺及其衍生物；b)碱性磷酸酶(ALP)化学发光免疫分析法，其常用的化学发光底物为1,2-二氧乙烷类衍生物；(2)电化学发光免疫分析法，如Roche公司的Elecsys系列和Cobas系列电化学发光免疫分析系统就是采用这种方法；(3)基于吖啶酯(acridinium ester)或吖啶磺酰胺(acridinium sulfonylamide)的化学发光免疫分析法，其化学发光试剂为吖啶酯或吖啶磺酰胺。

鲁米诺(luminol)、异鲁米诺(isoluminol)及其衍生物是最早在化学发光免疫分析法中使用的化学发光物质。不过，如果不使用增强剂，鲁米诺体系的发光为闪光型、强度弱、持续时间短。通过加入增强剂，发光时间明显延长，使其从短暂的闪光型改进为持续时间长的辉光型，增强了发光信号强度和提高了信噪比及灵敏度。提高灵敏度最有效的方法是在反应体系中加入增强剂以提高发光信号强度。增强剂的种类十分广泛，最初的增强剂包括荧光素、取代酚、萘酚和六羟基苯并噻唑，后来又发现了其它增强剂物质，如芳香胺、取代硼酸、靛酚等。

中国专利申请CN1067257A提及使用增强剂邻苯基苯酚的一种受保护的化合物，在检测时，加入相对应的水解酶，移除保护基团，产生实际发挥作用的增强剂邻苯基苯酚,提高鲁米诺的发光信号。但是这需要额外加入一种水解酶，从而导致反应体系复杂化，而且还会提高检测成本。再者，仅使用邻苯基苯酚一种增强剂虽然可提高鲁米诺的发光信号，但是仍然导致HRP-鲁米诺化学发光体系存在本底信号偏高和发光信号稳定性较差等问题。此外，邻苯基苯酚本身因某种未知的原因，使得增强的鲁米诺发光信号很难在较长的时间内保持稳定，发光信号衰减得比较快。这就使得很多人放弃使用这种增强剂。

发明内容