[发明专利]冬虫夏草菌培养液中蝙蝠蛾拟青霉的检测引物组、检测试剂盒和检测方法

权利要求书

1.冬虫夏草菌培养液中蝙蝠蛾拟青霉的检测引物组，其特征在于，包括2对特异引物：

第一对特异引物：

Ph816F：5’-CCTTTTGTGAACATACCTATC-3’；

Ph1302R：5’-GAGGTCAACGTTCAGAAGTC-3’；

第二对特异引物：

Ph935F：5’-GTATCTTCTGAATCCGCCGCA-3’；

Ph1162R：5’-CCGATTTCCCCAAAGGGAAG-3’。

2.一种冬虫夏草菌培养液中蝙蝠蛾拟青霉的检测试剂盒，包括PCR反应试剂和检测引物组，其特征在于，所述的检测引物组包括2对特异引物：

第一对特异引物：

Ph816F：5’-CCTTTTGTGAACATACCTATC-3’；

Ph1302R：5’-GAGGTCAACGTTCAGAAGTC-3’；

第二对特异引物：

Ph935F：5’-GTATCTTCTGAATCCGCCGCA-3’；

Ph1162R：5’-CCGATTTCCCCAAAGGGAAG-3’。

3.基于降低冬虫夏草菌侵染蝠蛾幼虫过程中幼虫感染蝙蝠蛾拟青霉死亡率目的的冬虫夏草菌培养液中蝙蝠蛾拟青霉的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：提取待测冬虫夏草菌培养液的基因组DNA作为模板，使用权利要求1所述的第一对特异引物Ph816F和Ph1302R进行第一轮PCR扩增，以稀释后的第一轮PCR扩增的PCR反应产物为模板，使用权利要求1所述的第二对特异引物Ph935F和Ph1162R进行第二轮PCR扩增，琼脂糖凝胶电泳检测第一轮和第二轮PCR扩增的PCR反应产物，若第一轮PCR产物在487bp处有电泳条带和第二轮PCR产物在228bp处有电泳条带，均说明冬虫夏草菌培养液中有蝙蝠蛾拟青霉，若无电泳条带，则说明冬虫夏草菌培养液中没有蝙蝠蛾拟青霉。

4.根据权利要求3所述的检测方法，其特征在于，所述的第一轮PCR扩增和第二轮PCR扩增，其反应体系均为25μL：包括10×Taq Buffer 2.5μL、2.5mM dNTPs 2μL、10μM正向引物0.5μL、10μM反向引物0.5μL、5U/μL高保真Taq DNA聚合酶0.5μL和模板DNA 2μL，余量用ddH2O补足至总体积25μL。

5.根据权利要求3所述的检测方法，其特征在于，所述的第一轮PCR扩增，其反应条件为：94℃ 3～5min；94℃ 30sec，48℃ 30sec，72℃ 30sec，35个循环；72℃ 5～10min。

6.根据权利要求3或5所述的检测方法，其特征在于，所述的第二轮PCR扩增，其反应条件为：94℃ 3～5min；94℃ 30sec，58℃ 30sec，72℃ 30sec，35个循环；72℃ 5～10min。