[发明专利]培养味觉干细胞的方法

说明书

技术领域

本发明属于细胞生物学领域，具体涉及一种培养味觉干细胞的方法。

背景技术

味觉的产生是由味觉细胞释放并传递味觉信号引起。味觉细胞的损伤和缺失导致味觉功能障碍甚至缺失。味觉细胞持续不停地更新和分化，更新周期为14天。动物通过舌头上的味蕾感受各种味道，包括苦、甜、咸、酸、鲜等。味蕾主要分布在前舌的菌状乳头以及后舌的丝状乳头和环状乳头。味蕾细胞按其形态和功能分为四大类。第一类为支持细胞，标记蛋白为NTPDaseII；第二类为味觉受体细胞，主要对苦味、甜味和鲜味刺激做出反应，标记蛋白为Gustducin、T1r3、P1cβ2以及Trpm5；第三类为突触前细胞，主要对咸味和酸味刺激做出反应，标记蛋白为Ca4和5-HT。位于味蕾底部的一类细胞为基底细胞，或称味觉干细胞，可以持续分化味觉细胞，使味蕾感受各种味道的刺激。

发明内容

本发明的目的在于提供一种培养味觉干细胞的方法，以获得具有功能的成熟味觉细胞。

本发明通过体外分离后舌环状乳头味蕾底部的味觉干细胞，将其吹打过滤出单个细胞，并培养在含有基质胶的培养基中，12～14天以后，味觉干细胞经分化，增殖为含有成熟味觉细胞的类器官。

含有基质胶的培养基系以DMEM/F12为基础培养基，还加入多种组分以刺激味觉干细胞的增殖与分化。基质胶为味觉干细胞进行三维培养提供营养，还起到固定支持细胞形态的作用。加入基础培养基中的各组分及其含量如下：

附图说明

图1为味觉干细胞培养不同天数的细胞图片，其中图中标记数字1、2、3、4、7、9和15分别表示培养第1天、第2天、第3天、第4天、第7天、第9天和第15天追踪拍摄的细胞影像；

图2为培养10天的味觉干细胞免疫染色影像，图A中，“BrdU”、“Sox2”和“DAPI”分别表示标记采用的方法，即“BrdU”标记增殖细胞，“Sox2”标记干细胞，以及“DAPI”标记细胞核；图B中，“K8”、“K5”和“DAPI”分别表示标记采用的方法，即“K8”标记分化味觉细胞，“K5”标记基底细胞，“DAPI”标记细胞核；

图3为培养14天的味觉干细胞免疫染色图片，其中“Gustducin”、“Car4”和“K8”分别表示标记采用的方法，即“Gustducin”标记II型味觉细胞，“Car4”标记III型味觉细胞，“K8”标记分化味觉细胞；

图4为培养14天的味觉干细胞钙成像结果，图A中，“Ace.K(Acesulfame K)”和“Sucralose”表示甜味试剂，分化细胞对两种甜味刺激都有反应；图B中，“Den.(Denatonium)”为苦味试剂，分化细胞对苦味刺激有反应，且浓度越高反应越大；U73122为Plcβ2通路抑制剂，可以抑制Den.引起的苦味反应，U73122去除后反应恢复，表明分化出的味觉细胞具有活性。

具体实施方式

以下结合附图详细描述本发明的技术方案。本发明实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围中。

1)将小鼠麻醉致死，剪刀剪开小鼠两颊，从舌根部剪下舌头，置于冰上预冷的PBS中。用冰冷的PBS洗两次，置于Tyrode’s缓冲液中。

2)用1ml注射器向舌头表皮与肌肉层中间下注射酶液，37℃放置15分钟。

3)用显微剪剪下后舌环状乳头区，并将其剪碎成尽量小的组织块。

4)0.25％胰酶37℃消化组织15分钟。

5)加入含FBS的DMEM培养基终止消化。

6)1200rpm离心5分钟，使组织沉淀。

7)去除胰酶，加入1ml完全培养基，用玻璃吸管吹打20次，获得细胞悬液。

8)将细胞悬液分别通过70μm和40μm的细胞筛网，获得单细胞悬液。

9)在单细胞悬液中加入基质胶，将细胞接种于低吸附孔板(如：低吸附能力的24孔板)上，置于37℃培养箱中培养。

10)每隔三天对细胞进行换液，至第8天左右开始长出味觉细胞，第14天味觉细胞成熟并有活性。

上述步骤1)中所述Tyrode’s缓冲液(pH7.4)配方为：145mM NaCl、5mM KCl、10mM Hepes缓冲液、5mM NaHCO₃、10mM丙酮酸盐和10mM葡萄糖。