[发明专利]一种与非小细胞肺癌相关的血浆环状RNA标志物检测方法

说明书

本发明公开了一种与非小细胞肺癌相关的血浆环状RNA标志物检测方法，包括以下步骤：步骤1、提取外周血血浆；步骤2、血浆RNA的提取；步骤3、Real‑Time RT PCR检测circRNA。该方法可应用于检测非小细胞肺癌发病相关的血浆环状RNA标志物，对于该肿瘤的诊断具有重要辅助作用。首次采用线虫circRNA作为内参，解决了当前无法较好定量circRNA的技术瓶颈。

技术领域

本发明属于生物医学技术领域，涉及一种与非小细胞肺癌相关的血浆环状RNA标志物检测方法。

背景技术

肺癌是目前全球受累人数最多的恶性肿瘤，5年生存率常低于15％。由于持续增长的烟草消费和日益加剧的环境污染，我国的肺癌发病和死亡形势日趋严峻，如不及时采取有效控制措施，预计到2025年，我国肺癌病人将达到100万，成为世界第一肺癌大国。研究表明，早期肺癌(I期)患者术后5年生存率可达到50％以上。因此，在肺癌早期予以确诊，并实施有效的治疗，是延长肺癌患者生存期以及生活质量的关键。

但截止目前，大部分肺癌确诊方法均有不同程度的缺点。作为诊断金标准的病理检查多为手术或穿刺获取靶组织检测，对患者生理和心理创伤均较大。而常用的肿瘤标志物如CEA,CA125,CA19-9和CYFRA21-1等则缺乏足够的灵敏度和特异度。此外，基于质谱技术的蛋白血清标志物为肿瘤早期诊断提供了一个新的探索方向，然而该技术难度大，成本高，并且血清蛋白作为标志物常受到其稳定性的限制。环状RNA是国际上新发现的一类非编码RNA，具有组织特异性、表达特异性及良好稳定性，被证明参与机体重要的生理和病理过程，有望成为新的生物标志物。

目前现有技术中急需一种血浆环状RNA(circRNA)标志物检测方法。

发明内容

本发明的目的在于提供一种与非小细胞肺癌相关的血浆环状RNA标志物检测方法。该方法可应用于检测非小细胞肺癌发病相关的血浆环状RNA标志物，对于该肿瘤的诊断具有重要辅助作用。首次采用线虫circRNA作为内参，解决了当前无法较好定量circRNA的技术瓶颈。

其具体技术方案为：

一种与非小细胞肺癌相关的血浆环状RNA标志物检测方法，包括以下步骤：

步骤1、提取外周血血浆：每个研究对象均采用真空抗凝EDTA采血管采集晨起空腹静脉血5ml，按标准方法在12小时内离心，分离血浆至1.5ml离心管中，保存两份，-80℃冷冻保存备用；

步骤2、血浆RNA的提取：12000rpm 4℃离心10min对200ul血浆进行预处理。参照Invitrogen公司Trizol LS试剂、Qiagen公司试剂盒RNeasy Plus Mini Kit操作流程提取血浆RNA，然后加入100ng线虫总RNA作为质控和内参标准，通过离心柱纯化血浆RNA，洗脱后-80℃保存备用，RNA的纯度和浓度采用NanoDrop ND-2000仪器检测；

步骤3、Real-Time RT PCR检测circRNA：设计circRNA特异性反向引物，采用Takara公司生产的逆转录试剂盒进行RNA逆转录，然后采用SYBR-Green染料法检测血浆circRNA表达水平，反应体系和条件参照试剂盒说明书进行，每个样本进行三次平行实验，以线虫circRNA为内参进行标化，采用ΔCt定量方法，2-ΔCt代表circRNA的相对表达值。

与现有技术相比，本发明的有益效果为：

1)circRNA在血浆中含量丰富、性质稳定、可定量检测；2)检测指标微创价廉，可应用于人群筛查和临床检测，易于推广应用；3)本发明也为其他疾病生物标志物的研究提供了技术指导。4)本发明结合了基础与临床、理论和应用，有望提高早期肺癌的临床诊断率，改善患者治疗效果及生存质量。

附图说明

图1是本发明与非小细胞肺癌相关的血浆环状RNA标志物检测方法的流程示意图；