[发明专利]一种大肠杆菌的发酵培养方法及其在饲料添加剂中的应用

说明书

本发明提供了一种大肠杆菌Escherichia coli Nissle 1917的发酵培养方法。在发酵过程初期控制葡萄糖流加量，后期采用蔗糖作为碳源的补充，降低了发酵后期抑制菌体生长乙酸的积累量，同时与优化的培养基和发酵条件相配合提高了活菌体数量，且批次间重复性稳定，有利于生产化工业控制。本发明还提供了以上述发酵培养方法所得大肠杆菌EcN为原料的饲料添加剂的制备方法，将赖氨酸盐酸盐、蛋氨酸、苏氨酸、甜味料和大肠杆菌EcN与水加热混匀后，得到饲料添加剂；通过各原料之间的协同作用，使得制得的饲料添加剂中的营养成分均匀，使用效果好，同时用于制备该添加剂的方法简单、原料易得。

技术领域

本发明具体涉及一种大肠杆菌的发酵培养方法及其在饲料添加剂中的应用。本发明属于生物技术领域。

背景技术

大肠杆菌Nissle 1917(Escherichia coli Nissle 1917，EcN)是由德国科学家Alfred Nissle于1917年分离出的一种优质益生菌，它具有多种优良性能，如改善肠道微生物群落，抑制病原菌生长，不含肠毒素等对人体致病的有害因子，对肿瘤具有高靶向性。研究发现EcN对常见胃肠道疾病有良好疗效，被广泛用于预防传染性腹泻、溃疡性结肠炎等炎性肠疾病，防止新生儿消化道内病原菌定殖等。目前该细菌作为益生菌，在德国、美国等地已广泛用于临床，主要用于治疗腹泻，同时也越来越多的作为疫苗，疾病诊断和抗肿瘤药物研发，这些研究的开展将使人类从EcN中获益更多。

目前在动物营养领域，有关EcN的研究并不多。众所周知，仔猪肠道发育不完善和肠道微生态区系复杂，断奶应激会损伤肠道黏膜，因此如何调控肠道健康已成为仔猪生长发育的关键。目前断奶仔猪腹泻率很高，在很大程度上影响了仔猪的生长性能，在治疗过程中，大量使用抗生素，造成了资源的浪费和药物的滥用，已有研究报道，口服益生菌EcN能显著降低断奶仔腹猪泻率和竞争性阻碍沙门氏菌入侵，同时能有效预防产毒素大肠杆菌的感染，降低断奶仔猪腹泻率，从而提高断奶仔猪的生长性能，起到部分替代抗生素的作用。但是目前将EcN作为饲料添加剂应用到动物营养中的相关报道尚未有发现。

发明内容

本发明的目的是为克服上述现有技术的不足，提供一种大肠杆菌的发酵培养方法及其在饲料添加剂中的应用。

为实现上述目的，采用下述技术方案。

一种大肠杆菌(Escherichia coli Nissle 1917，EcN)的发酵培养方法，包括以下步骤：

(1)菌种活化：将菌保管从-80℃超低温冷冻存储箱取出，待其解冻后吸取少量菌液划线于LB平板上，倒置于37℃恒温箱内过夜培养；

(2)摇瓶种子培养：挑取平板上的单菌落于LB液体培养基中，37℃培养4～5小时，摇床转速200rpm，OD₆₀₀值为1.5～2.0；

(3)发酵培养：将摇瓶种子液移入装有发酵培养基的发酵罐中进行扩大培养，接种量为0.67％(每100mLKB培养基加入0.67mL种子液)，培养周期为16小时，OD₆₀₀为42，湿重6.08g/100ml，干重2.125g/100ml，活细胞数5.67×10¹³CFU/mL；在发酵初期3小时、5小时分别流加占培养基体积分数2％的混合流加液Ⅰ，7小时、9小时、11小时、15小时分别流加占培养基体积分数2％的混合流加液Ⅱ。

优选的，步骤(2)所述LB培养基的各组分质量百分比为酵母浸粉0.5％，蛋白胨1％，氯化钠1％，其余为水。

优选的，步骤(3)所述发酵培养基的各组分质量百分比为葡萄糖1％，硫酸铵2.5％，玉米浆粉0.5％，磷酸二氢钾0.2％，硫酸亚铁0.05％，碳酸钙1％，其余为水。