[发明专利]用于检测猪口蹄疫病毒与塞内加谷病毒的双重PCR引物、检测方法及试剂盒

说明书

技术领域

本发明属于动物疫病检测技术领域，具体涉及一种用于检测猪口蹄疫病毒和塞内加谷病毒的双重PCR引物、检测方法及试剂盒。

背景技术

口蹄疫病毒(foot-and-mouth disease virus，FMDV)属于小RNA病毒科(Picornaviridae)，口蹄疫病毒属(Aphthovirus)的成员，为无囊膜的单股正链RNA。到目前为止，己经发现了7个血清型，80多个亚型和众多差异明显的病毒株。我国主要流行O型、A型和Asial I型。

塞内加谷病毒(Seneca Valley virus，SVV)是小核糖核酸病毒科 (Picornaviridae)Senecavirus病毒属的典型代表。Hales等通过对SVV-001遗传序列进行分析后将Senecavirus列为小RNA 病毒科的新的病毒属(Hales et al.,2008)，为无囊膜的单股正链RNA。SVV最初被认为是细胞培养物中的污染物，推测其来源于猪的胰酶或胎牛血清(Reddy et al.,2007)。到2007年，一批自加拿大运往美国明尼苏达州的猪鼻镜出现水泡，蹄部冠状带溃烂等类似水疱病症状，经检测排除口蹄疫、水泡性口炎病和猪水疱病，最终通过PCR检测确定为SVV阳性(Pasma T et al.,2008)。2014年11月，巴西也出现猪群感染SVV的报道。2015年3月，我国广东某猪场超期断奶猪被发现跛行，出现鼻镜水泡，送检水泡液、水泡皮、脚皮样品，检测结果显示猪口蹄疫、猪水疱病病原均阴性。继而查找资料，确定发病猪群感染SVV。随后在2015年10月、 11月及2016年1月、2月陆续在其他猪场发现猪群感染SVV病例。

由于SVV感染动物所引起的症状与其他病毒性疾病如口蹄疫临床表现十分相似，给临床确诊带来了难度。因此，需要实验室技术加以确定。目前主要包括病毒分离、抗体检测和抗原检测等。然而这些方法操作比较繁复，且很难准确区分塞内加谷病毒感染还是口蹄疫病毒感染。

因此，建立一种快速简便、特异性强、敏感性高、可靠性好的FMDV 和SVV联合检测鉴别方法，准确认别猪感染的病因并对症下药，对生猪养殖行业意义重大。

发明内容

为解决以上问题，本发明提供用于检测猪口蹄疫病毒和塞内加谷病毒的双重PCR引物、检测方法及试剂盒，建立一种能够同时鉴别诊断FMDV和 SVV病毒的双重PCR检测方法，且具有很高检测灵敏性与特异性，能够精准的鉴别诊断出猪感染的病因，从而实施正确的治疗方案，挽回经济损失。

本发明第一方面提供一种用于检测猪口蹄疫病毒和塞内加谷病毒的双重PCR引物，所述引物根据检测猪口蹄疫病毒和塞内加谷病毒的高度保守的特异性序列设计双重PCR引物，其中，猪口蹄疫病毒的检测引物，由SEQ ID NO： 1所示的核苷酸序列的正向引物和SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列的反向引物组成，检测猪塞内加谷病毒的检测引物，由SEQ ID NO：5所示的核苷酸序列的正向引物和SEQ ID NO：6所示的核苷酸序列的反向引物组成。

上述的检测猪口蹄疫病毒和塞内加谷病毒的双重PCR引物在制备检测猪口蹄疫病毒和塞内加谷病毒的制品中的应用。

本发明第二方面提供一种用于检测猪口蹄疫病毒和塞内加谷病毒的双重PCR检测方法，包括以下步骤：

1)从待检样品制备基因组总DNA；

2)以制备的基因组DNA为模板，利用如权利要求1所述的双重PCR引物，在同一反应体系中进行双重PCR扩增，得到扩增产物；

3)扩增产物经琼脂糖凝胶电泳，获得检测结果。

在本发明一实施例中，所述用于检测猪口蹄疫病毒和塞内加谷病毒的双重PCR反应体系总体积为50μl，包括：

1)10μM的SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO： 6所示核苷酸序列各1μl；

2)10×PCR Bμffer 5.0μl；

3)dNTP Mixtμre 4.0μl；

4)rTaq DNA聚合酶1.0μl；

5)RNase free ddH20 32.0μl；

6)待测样品的DNA模板4μl。

在本发明一实施例中，所述用于检测猪口蹄疫病毒和塞内加谷病毒的双重PCR反应条件包括：94℃预变性5min后进入循环；94℃变性30s，56℃退火30s，72℃延伸30s，35个循环结束后；72℃终延伸10min。