[发明专利]一种快速高效检测曼氏无针乌贼种群的方法在审
| 申请号： | 201711321725.0 | 申请日： | 2017-12-12 |
| 公开（公告）号： | CN108203735A | 公开（公告）日： | 2018-06-26 |
| 发明（设计）人： | 高天翔;陈治 | 申请（专利权）人： | 浙江海洋大学 |
| 主分类号： | C12Q1/6888 | 分类号： | C12Q1/6888;C12Q1/686 |
| 代理公司： | 杭州杭诚专利事务所有限公司 33109 | 代理人： | 尉伟敏 |
| 地址： | 316022 浙江省*** | 国省代码： | 浙江;33 |
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| 摘要： | |||
| 搜索关键词： | 曼氏无针乌贼 种群 检测 高效检测 分布检测 环境负担 目标物种 生存环境 物种种群 环境DNA 检测点 传动 取样 省力 省时 探针 引物 生态系统 泥沙 样本 损伤 调查 物种 采集 土壤 伤害 | ||
1.一种快速高效检测曼氏无针乌贼种群的方法，其特征在于，所述快速高效检测曼氏无针乌贼种群的方法包括以下步骤：
1）提取待检测环境的eDNA样本，对样本进行前处理；
2）将经过前处理的eDNA样本通过DNA抽提试剂盒进行DNA抽提，将抽提后的DNA溶于100μL水中得到DNA样本液；
3）对DNA样本液，采用特制的引物和探针进行qPCR反应；
4）对qPCR扩增产物进行测序和检测，测定Ct值，判定结果；
所述eDNA样本包括土壤、泥沙和水。
2.根据权利要求1所述的一种快速高效检测曼氏无针乌贼种群的方法，其特征在于，步骤3）中所述特制的引物分别为上游引物SEQ ID NO.1：5’-CACCAGACATAGCCTTCC-3’和下游引物SEQ ID NO.2：5’-GCCAGCATGAGATAGATTAC-3’；所述探针序列为SEQ ID NO.3：5’-HEX-TGTTCATCCAGTTCCAGCACCT-TAMRA-3’。
3.根据权利要求1或2所述的一种快速高效检测曼氏无针乌贼种群的方法，其特征在于，步骤1）中所述eDNA样本优选为水。
4.根据权利要求3所述的一种快速高效检测曼氏无针乌贼种群的方法，其特征在于，步骤1）中所述前处理方法为将eDNA样本滤膜置于酒精中进行充分浸泡保存或置于液氮中进行充分研磨。
5.根据权利要求1或2所述的一种快速高效检测曼氏无针乌贼种群的方法，其特征在于，步骤3）中所述探针为荧光PCR探针。
6.根据权利要求1或2所述的一种快速高效检测曼氏无针乌贼种群的方法，其特征在于，步骤3）中所述的qPCR扩增的反应体系组成为：PremixExTaq 10μL、10μM的上游引物SEQID NO.1取0.4μL、10μM的下游引物SEQ ID NO.2取0.4μL、10μM的探针SEQ ID NO.3取0.4μL和100g/μL的DNA模版液1μL，利用去离子水补足至20μL；
所述qPCR扩增条件为：95℃预变性10s，随后95℃变性5s，60℃退火23s，72℃延伸60s，变性、退火和延伸共进行40个循环，最后进行72℃延伸5min，4℃条件下保存。
7.根据权利要求6所述的一种快速高效检测曼氏无针乌贼种群的方法，其特征在于，所述的qPCR扩增采用荧光定量PCR仪进行反应。
8.根据权利要求1或2所述的一种快速高效检测曼氏无针乌贼种群的方法，其特征在于，所述步骤4）中测定Ct值，当Ct值小于或等于35时判定结果为阳性，当Ct值大于35时判定结果为阴性。
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