[发明专利]cfDNA捕获建库方法

说明书

本发明涉及一种cfDNA捕获建库方法，包括以下步骤：A.制作接头，对接头进行退火反应，纯化；B.对样本DNA进行处理，进行末端补齐反应；C.末端补齐的DNA片段进行加A反应；D.加A反应后的产物与接头进行连接反应；E.连接反应的产物采用探针组和单条引物对进行捕获延伸；F.捕获延伸后的产物采用上游引物和下游引物进行扩增得到文库。本发明的cfDNA捕获建库方法能够实现高灵敏度、快速、低成本的二代文库构建。

技术领域

本发明涉及一种基于Ion Torrent二代测序平台的DNA捕获建库方法，属于生物技术领域。

背景技术

新一代高通量基因检测技术，当今主要以Illumina公司的Hiseq，Miseq系列和Life公司的Ion TorrentTM系列测序仪为代表，有着其他技术不可比拟的高通量、低成本等优势。已被广泛用于各类生物学研究和医学检测。

目前肿瘤的发病率和死亡率高于其他疾病，针对肿瘤病人的治疗首选靶向治疗。由于肿瘤发病机制复杂，肿瘤细胞存在异质性，因此，同种癌种适合的靶向药会有所不同。针对同种癌种不同治，同一个病人不同时期不同治的要求，在用药前对病人进行靶点的全面筛查成为必要。

高通量测序技术使更全面更精准的筛选用药靶点成功实现。二代测序技术中的靶向测序同样具有巨大优势，由于测序的区域小，可以对某些区域进行深度测序，使得低频突变的检测率大大提高。肿瘤关键基因较多，适合使用二代测序对某些关键的基因进行深度测序，得到肿瘤致病突变信息及相关用药靶点信息。然而，传统靶点筛查需要取到病灶组织，这极大的限制了高通量测序技术在该领域的应用。开发以非侵入式诊断策略进行肿瘤基因诊断，成为新的需求，其中，最为突出的是对病人cfDNA进行检测是当前最具潜力的途径。由于cfDNA中所含来自肿瘤细胞的ctDNA往往使极微量的，因此，对检测灵敏度和准确度均提出了新的更高的要求。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种能够实现高灵敏度、快速、低成本的二代文库构建的cfDNA捕获建库方法。

本发明为解决上述技术问题提出的一种技术方案是：一种cfDNA捕获建库方法，包括以下步骤：

A.制作接头，对接头进行退火反应，纯化；

B.对样本DNA进行处理，进行末端补齐反应；

C.末端补齐的DNA片段进行加A反应；

D.加A反应后的产物与接头进行连接反应；

E.连接反应的产物采用探针组和单条引物对进行捕获延伸；

F.捕获延伸后的产物进行PCR扩增得到文库。

上述接头是双链接头，由单链a和单链b组成，所述单链b包括从3’端至5’端依次设置的互补序列区域、任意碱基序列区域、样本barcode区域和Ion接头A部分的序列；所述互补序列区域中包括与单链a的序列反向互补的序列。

上述单链a序列的碱基个数为13～16个；所述互补序列区域的碱基个数为17～20个；所述任意碱基序列区域是12个随机碱基；所述样本barcode区域的碱基个数为6个；所述Ion接头A部分的碱基个数为30～35个。

上述单链a的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，所述单链b的核苷酸序列如SEQ IDNo.2所示。

上述单链a的5’端设有磷酸化修饰；所述单链b的5’端的至少三个碱基上设有硫代磷修饰。