[发明专利]cfDNA捕获建库方法

权利要求书

1.一种cfDNA捕获建库方法，不用于疾病的诊断和治疗，其特征在于，包括以下步骤：

A．制作接头，对接头进行退火反应，纯化；

B．对样本DNA进行处理，进行末端补齐反应；

C．末端补齐的DNA片段进行加A反应；

D．加A反应后的产物与接头进行连接反应；

E．连接反应的产物采用探针组和单条引物对进行捕获延伸；

F．捕获延伸后的产物进行PCR扩增得到文库。

2.根据权利要求1所述的cfDNA捕获建库方法，其特征在于：所述接头是双链线形接头，由单链a和单链b组成，所述单链b包括从3’端至5’端依次设置的互补序列区域、任意碱基序列区域、样本barcode区域和Ion接头A部分的序列；所述互补序列区域中包括与单链a的序列反向互补的序列。

3.根据权利要求2所述的cfDNA捕获建库方法，其特征在于：所述单链a序列的碱基个数为13～16个；所述互补序列区域的碱基个数为17～20个；所述任意碱基序列区域是12个随机碱基；所述样本barcode区域的碱基个数为6个；所述Ion接头A部分的碱基个数为30～35个。

4.根据权利要求3所述的cfDNA捕获建库方法，其特征在于：所述单链a的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，所述单链b的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示。

5.根据权利要求4所述的cfDNA捕获建库方法，其特征在于：所述单链a的5’端设有磷酸化修饰；所述单链b的5’端的至少三个碱基上设有硫代磷修饰。

6.根据权利要求4所述的cfDNA捕获建库方法，其特征在于：所述步骤E中，所述探针组包括15个探针，分别是核苷酸序列如SEQ ID No.3所示的探针a，核苷酸序列如SEQ ID No.4所示的探针b，核苷酸序列如SEQ ID No.5所示的探针c，核苷酸序列如SEQ ID No.6所示的探针d，核苷酸序列如SEQ ID No.7所示的探针e，核苷酸序列如SEQ ID No.8所示的探针f，核苷酸序列如SEQ ID No.9所示的探针g，核苷酸序列如SEQ ID No.10所示的探针h，核苷酸序列如SEQ ID No.11所示的探针i，核苷酸序列如SEQ ID No.12所示的探针j，核苷酸序列如SEQ ID No.13所示的探针k，核苷酸序列如SEQ ID No.14所示的探针l，核苷酸序列如SEQID No.15所示的探针m，核苷酸序列如SEQ ID No.16所示的探针n，核苷酸序列如SEQ IDNo.17所示的探针o。

7.根据权利要求6所述的cfDNA捕获建库方法，其特征在于：所述步骤E中的反应体系中包括连接反应的产物19体积，探针组溶液2体积，单条引物溶液2体积，缓冲液3体积，dNTP溶液3体积，热启动酶0.3体积，纯水补足30体积；所述探针组中的各个探针在反应体系中的最终浓度均为1μM，所述单条引物在反应体系中的最终浓度为10μM。

8.根据权利要求7所述的cfDNA捕获建库方法，其特征在于：所述步骤E的反应条件是步骤一，在98℃，30min；步骤二，在98℃，20s，在65℃，15s，在72℃，30s，重复步骤二8次；步骤三，在72℃，5min；步骤四，保持在10℃。

9.根据权利要求6所述的cfDNA捕获建库方法，其特征在于：所述步骤E中，所述单条引物的核苷酸序列如SEQ ID No.18所示。

10.根据权利要求6所述的cfDNA捕获建库方法，其特征在于：所述步骤F中采用上游引物和下游引物进行PCR扩增，所述上游引物的核苷酸序列如SEQ ID No.19所示，所述上游引物的核苷酸序列如SEQ ID No.20所示；所述上下游引物在反应体系中的最终浓度均为10μM。