[发明专利]一种检测苯甲醇乙酰转移酶活性的方法

说明书

本发明涉及一种检测苯甲醇乙酰转移酶活性的方法。本方法运用DTNB能够与巯基相互作用形成有色的硫酚阴离子的反应机理，通过检测反应产物中巯基的生成量来测定蛋白样品的苯甲醇乙酰转移酶活性。本方法的优点是：实验操作步骤简单、样品用量较少以及检测结果灵敏准确。应用本方法可以较简易地从不同蛋白样品中筛选高效的苯甲醇乙酰转移酶。

技术领域

本发明属于生物化学技术领域，具体涉及一种在体外酶反应体系中检测待测蛋白样品中苯甲醇乙酰转移酶活性的方法。

背景技术

乙酸苯甲酯存在于许多植物的花和果实中，其生物合成途径是以苯甲醇和乙酰辅酶A为底物，在苯甲醇乙酰转移酶的作用下生成乙酸苯甲酯。

现有技术中没有较成熟的检测苯甲醇乙酰转移酶活性的方法，研究中一般是结合质谱技术对反应产物进行定性和定量，进而换算得到酶活性相关参数。然而，此方法操作步骤较繁琐，实验周期较长，成本较高，不利于生物合成途径中苯甲醇乙酰转移酶的开发和研究。

发明内容

为了克服上述现有技术的不足，本发明提供一种检测苯甲醇乙酰转移酶活性的新方法。所述方法有利于从生物中寻找高效的苯甲醇乙酰转移酶，并建立酶制备工艺和酶工程体系。

本发明所采用的技术方案如下：

一种检测待测蛋白样品中苯甲醇乙酰转移酶活性的方法，包括：将待测蛋白样品、DTNB(5,5'-二硫代双(2-硝基苯甲酸))、乙酰辅酶A、苯甲醇、MgCl₂加入水中混匀进行酶活反应，检测反应体系的吸光度，计算出巯基的生成量，进而计算出待测蛋白样品中苯甲醇乙酰转移酶的活性。

所述待测蛋白样品、DTNB、乙酰辅酶A、苯甲醇、MgCl₂的质量比为(100-5000)：(1480-5950)：(1510-12150)：(400-1630)：(3-15)；优选为(100-5000)：(1486.32-5945.26)：(1517.95-12143.56)：(405.49-1621.96)：(3.57-14.28)；进一步优选为1000：(2970-2980)：(3030-3050)：(800-820)：(7-8)；更进一步优选1000：2972.63：3035.89：810.98：7.14。

所述待测蛋白样品为组织粗提取蛋白或纯化蛋白，如梅花花瓣粗提取蛋白、烟草叶片粗提取蛋白。

所述MgCl₂的适量添加可有效维持酶活性。

所述酶活反应是在20-35℃水浴条件下进行，优选为30℃。

所述检测反应体系的吸光度是以反应开始为起点，每隔10-30min检测一次，如0、30、60、90、120min，直至反应结束。

所述吸光度的检测波长为412nm波长。

所述巯基的生成量的计算公式如下：

巯基含量(μmol/mg)＝73.53×(A_n-A₀)/C

其中，A_n为不同时间点反应体系在412nm波长的吸光度；

A₀为反应初始时间点0min，反应体系在412nm波长的吸光度；

C-蛋白样品量(mg)；

n为检测时间。

所述空白对照组是将实验组中待测蛋白样品替换为待测蛋白样品煮沸、离心后取得的上清液。

所述苯甲醇乙酰转移酶的活性的计算如下：