[发明专利]调节性T细胞体外扩增方法

说明书

本发明公开一种调节性T细胞体外扩增方法，主要包括：分离，从血液样品中先分离出CD4+CD127low T细胞，再从CD4+CD127low T细胞中分离出CD4+CD25+CD127low Treg细胞；激活细胞，将分离出的CD4+CD25+CD127low Treg细胞悬浮于培养基RPMI1640+10％FBS中，加入3‑8倍细胞数量的CD3/CD28MACS磁珠，将细胞放于培养板中并加入500U/mL人重组IL‑2，培养；扩增与培养细胞，细胞中加入500U/ml人重组IL‑2，继续培养；然后将细胞传代，继续加入500U/ml人重组IL‑2培养；收集所有细胞，离心去除培养基，将细胞与细胞培养基加入到6孔板中培养2‑3天；之后再次离心，将细胞与细胞培养基加入到细胞培养瓶中进行培养，每2‑3天换液一次，从细胞激活开始总共培养14‑22天，收集所有细胞。本发明的方法能够有效促进调节性T细胞的增殖，并确保扩增后调节性T细胞的纯度和功能。

技术领域

本发明涉及生物技术中的细胞培养技术领域，具体涉及一种调节性T细胞体外分选扩增方法及其使用。

背景技术

调节性T细胞(Treg)是一类控制体内自身免疫反应性的T细胞亚群，能够抑制免疫反应的细胞群，在免疫病理、移植物耐受、阻止自身免疫反应和维持机体免疫平衡方面发挥重要的作用。虽然在外周血细胞所占的比例低，仅占正常人外周血、脾脏组织CD4+T细胞的5％～10％，但是与肿瘤、自身免疫病、移植物的接受性等有密切的关系。

近年来，癌症免疫治疗的临床应用取得了显著进展，已经成为继手术、放疗、化疗、靶向治疗后癌症的另一有效治疗手段。在各种免疫治疗方式中，免疫检查点疗法是近几年获得突出疗效的治疗方法。免疫检查点是一类免疫抑制性的分子，可以调节免疫反应的强度和广度，从而避免正常组织的损伤和破坏，在肿瘤的发生、发展过程中，免疫检查点成为免疫耐受的主要原因之一。免疫检查点疗法就是通过共抑制或共刺激信号等一系列途径以调节T细胞活性来提高抗肿瘤免疫反应的治疗方法。许多免疫检查点分子在调节性T细胞上都有表达，例如CTLA-4，PD-1等。然而体内存在的调节性T细胞数量很少，仅占正常人外周血淋巴细胞的1-2％，体外获取后数量少，纯度不高，且细胞增殖能力低。因此，探索体外诱导和扩增高纯度调节性T细胞，建立更有效的细胞增殖培养方法，并在短期内获得有功能的调节性T细胞，是顺利开展免疫检查点与共刺激信分子抗体药物体外功能实验的重要前提。

正常人外周血中存在的调节性T细胞数量仅占CD4+T细胞的5-10％，并且传统的CD25+CD4+Treg分离方法不但获取细胞数量少，而且纯度低，尤其是体外扩增过程中真正起抑制作用的Treg并没有得到有效扩增，以至于最终获得的细胞中Treg数量非常少，无法顺利进展后续的体外功能实验。而如何选择合适的分选标志物，加入哪些激活物与细胞因子来促进Treg细胞增殖，确保扩增后细胞的纯度和功能，是目前急待解决的问题。

发明内容

本发明所要解决的技术问题在于，提供一种调节性T细胞体外扩增方法，能够有效促进调节性T细胞的增殖，并确保扩增后调节性T细胞的纯度和功能。

为解决上述技术问题，本发明提供的调节性T细胞体外扩增方法，包括步骤：