[发明专利]调节性T细胞体外扩增方法

权利要求书

1.一种调节性T细胞体外扩增方法，其特征在于，包括以下步骤：

第一步：分离，从血液样品中直接分离出CD4+CD127low T细胞，再从CD4+CD127low T细胞中分离出CD25+T细胞，即获得CD4+CD25+CD127low Treg细胞；

第二步：激活细胞，将分离出的CD4+CD25+CD127low Treg细胞悬浮于培养基RPMI1640+10％FBS中，加入3-8倍细胞数量的CD3/CD28MACS磁珠，将细胞按照每孔0.5～1×105放于培养板中，并加入终浓度500U/mL人重组IL-2，置于细胞培养箱培养12-20小时；

第三步：扩增与培养细胞，在第二步的细胞中加入终浓度500U/ml人重组IL-2，混合均匀，继续放入细胞培养箱中培养2-3天；然后按照培养板每孔1×105将细胞传代，继续加入终浓度500U/ml人重组IL-2，培养2-3天；收集所有细胞，离心去除培养基，将细胞与混有500U/ml人重组IL-2的细胞培养基PRMI1640+10％FBS加入到6孔板中，培养2-3天；之后再次离心去除培养基，将细胞与混有500U/ml人重组IL-2的细胞培养基PRMI1640+10％FBS加入到细胞培养瓶中进行培养，每2-3天使用相同组分的细胞培养基换液一次，直至从细胞激活开始总共培养14-22天，之后收集所有细胞。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述第一步中，使用磁珠分选试剂盒分离出CD4+CD127low T细胞以及CD4+CD25+CD127low Treg细胞。

3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述第二步中，加入5倍于细胞数量的CD3/CD28磁珠，培养板中每孔为1×105个细胞。

4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述第二步中，培养板为U型96孔细胞培养板，细胞培养箱的培养条件为37℃、5％CO2培养。

5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述第三步中，细胞培养瓶为T25细胞培养瓶。

6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述第三步之后，取收集的部分细胞，使用流式细胞术检测细胞表型。

7.如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述流式细胞术检测细胞表型的具体方法是，采用流式细胞术，使用anti-CD25、anti-CD127检测细胞表面CD25与CD127分子，使用anti-Foxp3检测细胞内Foxp3分子表达。

8.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述第三步之后，取收集的部分细胞，用于体外混合淋巴反应实验鉴定其调节性T细胞的功能。