[发明专利]合成钴（II）啉酸a，c-二酰胺的大肠杆菌重组菌及其构建方法与应用

说明书

本发明提供了一种合成CBAD的大肠杆菌重组菌及其构建方法与应用。具体地，本发明以大肠杆菌为出发菌株，构建了包含尿卟啉原III基因模块并且内源的血红素合成基因的表达被下调的工程菌，所述工程菌可以提高HBA的前体尿卟啉原III的积累，并且可以降低血红素途径通量，从而进一步提高HBA产量。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，更具体地涉及合成钴(II)啉酸a，c-二酰胺的大肠杆菌重组菌及其构建方法与应用。

背景技术

钴(II)啉酸a，c-二酰胺(Cob(II)yrinic acid a,c-diamide，CBAD)是合成维生素B₁₂的前体。在大肠杆菌中表达腺苷钴胺素合成基因cobAIGJMFKLH、cobB、cobNST、cbiMNQO，可以得到钴(II)啉酸a，c-二酰胺。但是现有技术中钴(II) 啉酸a，c-二酰胺的产量很低，必然导致维生素B₁₂的产量低。LC-MS没有检测到Hydrogenobyrinic acid(HBA)，说明HBA的产量低可能是钴(II)啉酸a，c- 二酰胺产量低的直接原因。

δ-aminolevulinate(ALA)是合成维生素B₁₂的前体，大肠杆菌自身可以通过C₅途径合成ALA。利用大肠杆菌来合成ALA的研究比较多，多数都是通过构建异源的C₄途径。表达光合细菌如Rhodobacter sphaeroides、Rhodopseudomonas palustris的ALA合成酶基因hemA、hemO都可以使大肠杆菌积累ALA。

目前，现有技术中利用大肠杆菌合成钴(II)啉酸a，c-二酰胺的产量都不高，不能满足工业生产的需求。因此，本领域迫切需要开发适用于工业生产的合成钴(II)啉酸a，c-二酰胺的大肠杆菌重组菌及其构建方法与应用。

发明内容

本发明的目的在于提供合成钴(II)啉酸a，c-二酰胺的大肠杆菌重组菌及其构建方法与应用。

在本发明的第一方面，提供了一种用于生产CBAD(钴(II)啉酸a，c-二酰胺) 或其前体的工程菌，所述工程菌为大肠杆菌，并且所述工程菌含有外源的基因模块 (genemodule)，所述的基因模块包括：

(a)尿卟啉原III基因模块，所述尿卟啉原III基因模块表达用于生物合成尿卟啉原III的基因；

较佳地，所述的用于生物合成尿卟啉原III的基因包括：hemA或hemO基因、 hemB基因、hemC基因、和hemD基因；

并且，所述工程菌的内源的血红素合成基因的表达被下调；

较佳地，所述的血红素合成基因包括：hemE基因、hemF基因、hemG基因、和 /或hemH基因。

在另一优选例中，所述工程菌的内源基因endA被下调或缺失。

在另一优选例中，所述的尿卟啉原III基因模块整合在基因组上，较佳地整合于阿拉伯糖诱导的启动子P_BAD位点。

在另一优选例中，所述的hemA基因、hemO基因、hemB基因、hemC基因和 hemD基因各自独立地来源于：Rhodobacter capsulatus菌株、Sinorhizobium meliloti菌株、Rhodopseudomonas palustri菌株、Brucella melitensis菌株、 Rhodobactersphaeroides菌株、或Brucella melitensis菌株；

优选地，hemA基因来源于Sinorhizobium meliloti菌株、或R.palustri菌株，

hemO基因来源于R.palustri菌株；