[发明专利]一种成熟的多能干细胞来源肝脏细胞的获取方法

说明书

本发明提供了一种成熟的多能干细胞来源肝脏细胞（iHeps）的获取方法，其包括以下步骤：定向分化人多能干细胞hPSCs到iHeps;移植iHeps至动物肝脏中，促进iHeps成熟，使iHeps在动物体内扩增及增殖；将iHeps在动物体内进行次第传代。采用本发明的技术方案，通过添加细胞生长因子及间充质干细胞的方法，可提高iHeps在动物肝脏内的整合率，从而可以促进iHeps在体内进一步成熟，然后通过第次体内传代的方法使iHeps在动物体内进行多轮扩增和成熟，最终获得和人原代肝细胞整合率近似得iHeps，该方法简便易行，3轮传代后获得的iHeps即具有和原代肝细胞类似的特性。

技术领域

本发明属于生物工程技术领域，尤其涉及一种成熟的多能干细胞来源肝脏细胞的获取方法。

背景技术

肝脏是人体最大的解毒工厂，肝脏通过细胞色素酶P450（CYP）家族代谢化学物质，通过氧化、还原、或水解反应，使这些化学物质绝大多会失去原有活性。正由于肝脏的解毒功能，药物是肝损害的重要病因之一。药物引起肝病的机制因药而异，非常复杂，大多数情况下尚不清楚。有些药物具有直接的毒性作用，损害与药物剂量有关；另一些药物仅偶尔在敏感的个体引起肝损伤，而且与剂量无关。因此，药物开发过程中，肝脏毒性测试尤为重要。虽然在预测新药对人体的毒性的时候动物常常是不错的模型，但是物种差异导致的代谢差异也是无法忽略的。此外，尽量减少实验动物的使用数量也是监管部门和动物福利部门的一致以来在努力践行的，通过细胞水平的体外初筛可以大大降低成本并提高药物筛选效率。

尽管肝脏是人类大器官中唯一可再生的器官，切除掉2/3的肝叶在数周时间内仍可以再生为一个和原来大小类似的完整肝脏。然而，肝脏细胞分离出来后在培养皿中却无法扩增和传代，在1-2周的时间内即去分化，失去解毒功能。因此，在体外毒性测试中，原代肝细胞是最好的候选，但来源严重不足和使用时间窗口也很短。因此，寻求其他方法获取肝脏细胞尤为重要。

近年来开始有不少研究开始探索使用人多能干细胞（hPSC），包括人胚胎干细胞（hESC）或人诱导多能干细胞（hiPSC）分化为肝脏细胞（iHeps）。这种技术的优势在于hESC和hiPSC可以无限扩增，通过定向分化，可以带来取之不竭的肝脏细胞。而hiPSC经过10年的蓬勃发展，全球已建立了多组织来源，包含有多种疾病突变基因型，以及多株经过基因修饰后细胞系。这不但可以为我们提供用于毒性测试的肝脏细胞，也大大丰富了我们在进行肝脏疾病模型构建时的体外模型资源。

肝样细胞能表达人原代肝细胞的标志物，如人血白蛋白（ALB），A1-抗胰蛋白酶（AAT），人去唾液酸糖蛋白受体（ASGPR），但是用于解毒功能的细胞色素酶仍不成熟，其功能有限；将iHeps移植入免疫缺陷小鼠，和原代肝脏细胞相比，其整合率仍然较低，人血清白蛋白表达的水平也较低。这些特性限制了iHeps在多个领域的应用。因此，如何获得成熟的多能干细胞来源的肝脏细胞具有重大现实意义。

发明内容

针对以上技术问题，本发明公开了一种成熟的多能干细胞来源肝脏细胞的获取方法，通过FAH敲除的免疫缺陷动物体内传代的方法，同时添加细胞因子，促进人多能干细胞来源的肝脏细胞成熟，使之可以在动物体内扩增及快速增殖。同时，使从动物肝脏分离下来的人肝脏细胞更加成熟，可以用于新药毒性测试及构建人工肝脏。

对此，本发明采用的技术方案为：

一种成熟的多能干细胞来源肝脏细胞的获取方法，其包括以下步骤：

步骤S1，定向分化人多能干细胞hPSCs到肝脏细胞iHeps；

步骤S2，移植肝脏细胞iHeps至动物体内，使肝脏细胞iHeps在动物体内扩增及增殖，并促进其成熟，

步骤S3，将肝脏细胞iHeps在动物体内进行次第传代。

其中，动物包括但不限于小鼠、大鼠、兔子、猴子。优选的，所述动物体为小鼠或新西兰大白兔。