[发明专利]一种成熟的多能干细胞来源肝脏细胞的获取方法

权利要求书

1.一种成熟的多能干细胞来源肝脏细胞的获取方法，其特征在于：其包括以下步骤：

步骤S1，定向分化人多能干细胞hPSCs到肝脏细胞iHeps；

步骤S2，移植肝脏细胞iHeps至动物体内，促进肝脏细胞iHeps成熟，并在动物体内扩增及增殖；

步骤S3，将肝脏细胞iHeps从动物体内进行第次传代；

其中步骤S1包括以下子步骤：

步骤S101，将hPSCs种到Matrigel包被的六孔板上，培养基为mTeSR1，添加5 uM的ROCK抑制剂；培养箱条件设定为37℃、5% CO₂，保持湿润；24小时和48小时后分别使用新鲜的mTeSR1换液；

步骤S102，72小时后开始分化，设定时间为day 0，使用RPMI 1640清洗一次细胞，然后添加含有RPMI 1640+ 100 ng/ml Activin A+ 25 ng/ml WNT3a的培养基开始诱导；

步骤S103，day 1和day 2 分别使用含有RPMI 1640 + 100 ng/ml Activin A的培养基换液；

步骤S104，day 3，使用 Knockout DMEM清洗贴壁细胞一次，使用KSR/DMSO 培养基培养；此后使用同样的培养基每2天换液一次，直至day 10；

步骤S105，day 10，添加 Hepatocyte Basal Medium，然后加入Hepatocyte CultureMedium、 20 ng/ml human hepatic growth factor、20 ng/mloncostatin M促进iHeps成熟；此后每两天使用同样培养基换液一次；

步骤S2中，移植肝脏细胞iHeps至动物体内时，添加细胞生长因子及人间充质干细胞，提高iHeps在动物肝脏内的嵌合率；

步骤S3中包括以下子步骤：取第一轮移植动物血浆人血白蛋白水平最高的动物，使用胶原酶肝脏灌注，获得单细胞悬液后，使用去动物细胞试剂盒去除动物细胞，再次移植动物进行第二轮传代 ，然后同样的方法移植第三轮；3-12个月后测定血浆人血白蛋白含量，做胶原酶肝脏灌注，获取单个肝脏细胞备用。

2.根据权利要求1所述的成熟的多能干细胞来源肝脏细胞的获取方法，其特征在于：步骤S2中，所述动物包括为小鼠、大鼠、兔子或猴子。

3.根据权利要求2所述的成熟的多能干细胞来源肝脏细胞的获取方法，其特征在于：步骤S2，包括以下子步骤：

步骤S201，用PBS清洗培养皿中的iHeps两次，然后每孔加入TrypLE和DNase I；

步骤S202，显微镜下观察细胞形态，当超过50%的细胞变圆时，使用等体积的RPMI 1640+ 20 % KSR吹下iHeps，收集到离心管中；重复上述步骤直至将所有的细胞都收集至离心管中，进行离心；

步骤S203，去除上清，使用PBS 重悬细胞；补加PBS，使用 40 µm 孔径细胞筛过滤细胞，移除细胞团块；

步骤S204，取出需要的细胞量，离心去上清；

步骤S205，复苏人脐带来源的间充质干细胞，计数，按照与iHeps的活细胞数目比例1:3~1:6混合，得到细胞混合液；

步骤S206，使用PBS、100 ng- 100 ug/ml HGF、0.1-100uM氢化可的松的混合液重悬上述细胞混合液，使得细胞浓度为4-6千万/ml，然后与细胞悬液等体积的Matrigel混合，使得细胞浓度为2-3千万细胞/ml；使用预冷的黄色枪头轻轻吹打均匀；

步骤S207，将胰岛素注射器置于冰上，吸取细胞悬液注入注射器中，并将注射器腔体中的空气挤出；将注射器放入冰上待用；

步骤S208，使用脾脏注射的方法，将细胞悬液注射入动物脾脏。

4.根据权利要求3所述的成熟的多能干细胞来源肝脏细胞的获取方法，其特征在于：步骤S202和步骤S204中，离心时，使用4℃离心机以200 G离心3 分钟。

5.根据权利要求1所述的成熟的多能干细胞来源肝脏细胞的获取方法，其特征在于：

day 15-day17，将细胞通过脾脏移植入动物肝脏内。

6.根据权利要求1所述的成熟的多能干细胞来源肝脏细胞的获取方法，其特征在于：

所述KSR/DMSO 培养基的成分为20% Knockout Serum Replacement + 1x NEAA + 1xGlutaMax + 0.1 mM beta-mercaptoethanol + 1% DMSO in Knockout DMEM medium。