[发明专利]一种罗湖病毒的RT-LAMP检测引物组、试剂盒及方法

说明书

本发明公开了一种罗湖病毒的RT‑LAMP检测引物组、试剂盒及方法。本发明试剂盒包括RT‑LAMP反应液、Bst DNA聚合酶、AMV反转录酶、荧光染料，RT‑LAMP引物组，蒸馏水，阳性和阴性对照样品；所述的RT‑LAMP组由一对外引物、一对内引物和一对环引物组成。本发明罗湖病毒RT‑LAMP检测试剂盒具有操作简便、特异性强、灵敏度高、快速准确等特点，非常适用于出口检疫及养殖场的现场检测，易于大规模推广应用。

技术领域

本发明属于病毒分子生物学领域，具体涉及一种罗湖病毒的RT-LAMP可视化快速检测试剂盒，更具体涉及一种罗湖病毒的RT-LAMP引物组、检测方法及其可视化快速检测试剂盒。

背景技术

从2000年至今，我国罗非鱼养殖量一直居世界第一，近年来，我国罗非鱼养殖产量仍保持增长态势，2015 年总产量约178 万t，约占全球总产量的30%。罗非鱼产业作为我国出口导向型产业，主要依靠出口贸易来维持产业运转。国内共有133家罗非鱼加工出口企业，总出口量约40 万吨，销往97 个国家和地区。2002 年开始我国罗非鱼的出口量与出口额基本都呈持续增长的态势，2005年罗非鱼出口量为10.74 万吨，2009 年为25.89 万吨，2013年为40.67 万吨，创下历史最高水平，总出口额为15.13 亿美元。罗非鱼养殖已成为我国出口创汇和渔民增收的重要途径。然而，近年来以色列、厄瓜多尔和埃及等国相继暴发的与病毒有关的养殖和野生罗非鱼大量死亡事件，给这些国家的罗非鱼养殖业造成了重大损失。经研究发现引起这些死鱼事件的病原均为罗湖病毒（Tilapia lake virus，TiLV），是一种新型鱼RNA 病毒。从以色列和厄瓜多尔死鱼事件中病鱼的肝、脑病灶中均发现病毒核酸，同时观察到由病鱼组织分离到的TiLV 在培养细胞中繁殖后，接种到健康鱼体内后，可产生相同症状的疾病，提示TiLV 为以色列和厄瓜多尔死鱼事件的病因。以色列和埃及两国相邻，但另一个地理上相隔甚远的南美国家厄瓜多尔也发生了由同种病毒引起死鱼事也发生了由TiLV 导致的大规模死鱼事件，说明该病毒已经对全球性罗非鱼养殖业造成了威胁。

罗湖病毒病是近几年新出现的一种高致病性和高死亡率的罗非鱼病毒病，病原为罗湖病毒（Tilapia lake virus，TiLV），感染该病毒的罗非鱼死亡率高达90%以上，TiLV为正粘样病毒科，负链RNA病毒，基因组分为10个节段。截止目前为止，厄瓜多尔、以色列、哥伦比亚、埃及、泰国等多个国家和区域均由此病爆发的报道，中国目前虽然未见罗湖病毒病的相关报道，但多地爆发的罗非鱼病害，其症状与罗湖病毒病及其相似，并且已检测出TiLV，但国内罗湖病毒的流行情况还完全未知。针对TiLV的检测方法，有巢式和半巢式RT-PCR，和原位杂交，这些检测方法操作过程均较为复杂，耗时长，需要特定的仪器设备，且巢式和半巢式RT-PCR的假阳性率比较高，因此，已有的这些检测方法都不适用于罗湖病毒的高效、快速现场检测。

LAMP技术是2000年由日本学者Notomi等发明的一种恒温扩增方法，它通过针对靶基因的6个区域而设计4对特异性引物，只有在引物与靶序列结合扩增反应才能进行，特异性很高。在60-65℃等温条件下利用链置换DNA聚合酶催化几十分钟就可以扩增出10⁹靶序列拷贝。相对于传统的核酸扩增方法，LAMP法扩增克服了需要昂贵仪器的特点，整个检测过程在等温条件下只需要1-2个小时就可以完成；该方法还具有很高的敏感性和特异性，且在反应体系中加入染料之后可以通过肉眼观察颜色的变化就能进行结果判定。该技术自产生之后已经在转基因食品检测、动物疫病诊断及动物胚胎的性别鉴定等领域得到广泛的推广及应用。LAMP适合基层养殖户及出入境检疫对病原进行快速检测。因此，建立TiLV的RT-LAMP快速检测的技术，不仅可以做到对罗湖病毒进行快速检测，而且可以简化操作程序、节约成本。对于罗湖病毒病的流行病学调查、病原监测及早期预警都具有重要的意义。

发明内容

为了解决上述存在的问题，本发明提供了一种罗湖病毒的RT-LAMP可视化快速检测试剂盒，在罗湖病毒特异性检测中，使用RT-LAMP检测试剂盒完成对罗湖病毒的特异性检测，通过反应产物中加入荧光染料后的颜色变化来判断被测样品是否含有TiLV。