[发明专利]一种新型T细胞免疫调节剂生物活性检测方法

说明书

本发明涉及生物医药技术领域，具体公开了一种新型T细胞免疫调节剂生物活性检测方法。本发明将表达睡美人转座酶的真核表达质粒和共表达抗性基因、不同响应元件驱动的报告基因，并在报告基因和共表达抗性基因两端插入转座子反向重复序列的真核表达质粒，共同转入宿主Jurkat T细胞，经加压筛选和单克隆分离得到稳定单克隆效应细胞，加入靶细胞和T细胞活化调节剂，通过测量报告基因的活性来测定T细胞免疫调节剂的生物活性。本发明可以应用于PD‑1/PD‑L1单抗、CTAL4‑Fc融合蛋白等细胞免疫调节剂的生物活性报告基因法检测体系。本发明不需要任何人血液来源的细胞成分或其它成分，测试结果稳定，操作简便，测试时间短，非常适宜后期对药物质量控制以及批次放行检测，可以广泛应用。

技术领域

本发明涉及生物医药技术领域，具体地说是涉及一种采用睡美人转座子系统建立T细胞免疫调节剂的生物活性检测方法。

背景技术

转座子又称可移动基因，跳跃基因，是一种可在基因组内插入和切离并能改变自身位置的DNA序列。早在20世纪50年代，首先由McClintock在玉米中发现，随后又陆续在细菌、真菌及动植物中发现，如细菌中的Tn5，酵母中的Ty以及来源于鳞翅目昆虫的piggyBac转座子等。睡美人(Sleeping Beauty，SB)转座系统是Tc1/mariner转座子超家族中的一员，已经失活了一千多万年；1997年，Ivics等根据积累的系统发生数据，利用生物信息学的方法，对其进行分子重建，终于唤醒了其转座活性，恢复跳跃能力，因此被命名“睡美人”。SB转座子由两部分组成，转座酶基因和能够被转座酶识别的两端反向重复序列(terminalinverted repeat，ITR)。转座酶的开放式阅读框编码340个氨基酸的蛋白质，它可以与两端的反向重复序列相结合，促进转座的发生。两端的反向重复序列长约230bp，由外侧的32bp反向重复序列、内侧与IR相似的同向重复序列(DR)以及两者间相距165bp-166bp的片段3个部分等组成。DR是转座酶的结合区域，是转座子的严格保守区。

SB转座子使用经典的“剪切-粘贴”(Cut-and-Paste)的作用机制进行转座。转座酶特异性识别DR，与细胞内的一种高度保守蛋白-高迁移率族蛋白1(high mobility groupbox-1 protein，HMGB1)结合形成突起复合物；此时，转座酶催化转座子的切除，释放转座子序列，并插入到新的整合位点上。一般情况下，SB转座子能特异性的整合到基因组中的TA双核苷酸位点。

在实际的研究中，则是将SB转座子的两个功能成分(转座酶和ITR)分开，将这两个成分以双质粒系统进行构建；即将编码转座酶基因的序列从转座子中分离下来，构建成一个独立的表达载体，而转座酶基因原来的位置则可以被其它的DNA序列(兴趣基因及相关启动子等)代替，构建成另外一个载体；利用这种双质粒系统，SB转座子可以携带外源DNA序列整合到染色体上，并在细胞和体内稳定表达。显然地，睡美人转座子将成为天然并容易控制的 DNA序列转移载体，并成为遗传工程包括基因治疗领域中广泛使用的工具。

目前基因递送系统可以分为整合型和非整合型系统，其中能将外源基因稳定整合至真核宿主染色体的整合型系统包括逆转录病毒载体、慢病毒载体以及睡美人、piggyBac(PB)转座子系统。相对于其他常用的基因递送载体，睡美人转座子具有其无可比拟的优势：1.能将外源基因永久整合插入到宿主染色体基因组上；2.工业化生产简单、廉价；3.免疫原性低，体内安全性高；4.具有很大的外源基因包装能力，甚至可包装100kb以上的BACs。