[发明专利]一种新型T细胞免疫调节剂生物活性检测方法

权利要求书

1.一种新型T细胞免疫调节剂生物活性检测方法，其特征在于，所述方法包括：

步骤一：T细胞活化基因的反式转录调控元件驱动的报告基因载体构建；

全基因合成所述反式转录调控元件序列，其中，所述反式转录调控元件序列上游带有KpnI酶切位点GGTACC，下游带HindIII酶切位点AAGCTT；

全基因合成产物与pGL4.15质粒经KpnI和HindIII酶切后，插入到pGL4.15载体上，构建报告基因载体；

所述步骤一中，所述报告基因为萤光素酶；所述T细胞活化基因为IL-2或NFAT；所述反式转录调控元件为IL-2启动子序列或NFAT响应元件，所述IL-2启动子序列为SEQ ID No.4所示，所述NFAT响应元件的序列如SEQ ID No.5所示；

步骤二：在萤光素酶基因两端插入睡美人转座子末端反向重复序列；

全基因合成睡美人转座子末端反向重复序列的左臂和右臂，其中，所述睡美人转座子末端反向重复序列的左臂经kpnI单酶切，所述睡美人转座子末端反向重复序列的右臂经SalI单酶切，分别插入至测序正确的步骤一中所述的报告基因载体上；

所述步骤二中，所述睡美人转座子末端反向重复序列的左臂的序列如SEQ ID NO:1所示，所述睡美人转座子末端反向重复序列的右臂的序列如SEQ ID NO:2所示；

步骤三：构建转座酶的表达载体；

全基因合成转座酶基因，其中，所述转座酶基因上游携带BamH I酶切位点，下游携带有Not I酶切位点；将合成序列经BamH I和Not I双酶切后，插入到pcDNA3.1真核表达载体上，即构建转座酶的表达载体；

所述步骤三中，所述转座酶为SB11；所述SB11转座酶的基因序列为SEQ ID No.3；

步骤四：将睡美人转座子的双质粒系统电转Jurkat T细胞，筛选IL-2启动子驱动萤光素酶稳定细胞株或NFAT RE驱动萤光素酶稳定细胞株：

睡美人转座子的双质粒系统电转Jurkat T细胞，具体包括如下步骤：

(1)提前1天传代Jurkat细胞；

(2)取RPMI1640生长培养基+10％牛血清+1％双抗加入6孔板的两孔中，2ml/孔，在培养箱中预热；另取220μl Cell line Nucleofector Solution V在培养箱中预热10min；

(3)取5μg所述报告基因载体放置于EP管中，然后再加入0.5μg所述转座酶的表达载体混合备用；

(4)Nucleofector电转仪开机，选择程序X-001；

(5)Jurkat细胞计数，取100万个细胞于1支离心管中，90g离心5min，弃尽上清；

(6)将预热的Cell line Nucleofector Solution V取100μl加入细胞沉淀中，后轻吹混匀，将细胞悬液加入放有所述报告基因载体的EP管中，再轻吹转至电转杯中；

(7)将电转杯放入电转仪，按‘X’键，完成电转后，用试剂盒提供的吸管取500μl预热的培养基加入电转杯底部略吹吸后吸出细胞，加至已加入1ml预热培养基的6孔板中，继续培养24h；

加压筛选及稳定单克隆细胞株分离培养，具体包括如下步骤：

(1)转染后24h，加入潮霉素选择培养基，筛选3周，每3-4天更换一次选择培养基；

(2)待对照组细胞全死，筛选完成，计数，选择培养基稀释至30个细胞/15ml，150μl/孔铺至U-96孔板；

(3)用选择培养基培养2周，显微镜下观察，挑选有单克隆生长的细胞孔，并转移至24孔板，1周后再传至6孔板扩大培养，即得到稳定细胞株；

步骤五：对T细胞活化调节剂的生物活性进行检测，其检测方法包括：在第一信号和第二信号的双信号系统共同作用下，步骤四中稳定细胞株被激活，T细胞活化基因的反式转录调控元件驱动的报告基因表达上调或下降，同步加入T细胞活化调节剂，通过检测报告基因的表达量，定量评估T细胞活化调节剂生物学活性；

所述步骤五中，所述第一信号和第二信号的双信号系统为CD3抗体和表达CD80/86细胞，或CD3抗体和表达PD-1/PD-L1细胞；

所述T细胞活化调节剂为CTLA4-Fc融合蛋白、PD-1单克隆抗体或PD-L1单克隆抗体。