[发明专利]烧土火丝菌天然抗菌肽及其应用

说明书

本发明公开了一组烧土火丝菌天然抗菌肽，其氨基酸序列分别如SEQ ID NO:5‑8所示。通过检索真菌蛋白数据库，筛选分析获得抗菌肽成熟肽序列，通过对比分析，该组天然抗菌肽与目前已知所有抗菌肽的氨基酸序列存在明显差异，属于新型抗菌肽。该组抗菌肽经密码子优化后实现其在毕赤酵母中的重组表达。抗菌实验结果表明，本发明的抗菌肽对革兰氏阳性菌，尤其是金黄色葡萄球菌ATCC43300，猪链球菌CVCC 3928，CVCC 606具有显著抑菌活性，可应用于抗菌药物、食品添加剂、化妆品、饲料添加剂、防腐剂等领域，具有广阔的应用价值和市场前景。

技术领域

本发明涉及生物医药领域，，具体地说，涉及烧土火丝菌天然抗菌肽及其应用。

背景技术

抗生素对感染性疾病的治疗发挥了重要作用，但由于抗生素滥用，耐药菌株不断增加，现已出现多种超级细菌，病原菌耐药性问题已被世界卫生组织(WHO)列为未来人类健康面临的主要威胁和挑战之一。金黄色葡萄球菌是人类重要病原菌，常引起食物中毒和伤口感染，在动物养殖业中主要引起牛、羊的乳房炎。原料奶中金黄色葡萄球菌易产生金黄色葡萄球菌肠毒素等有害物质而污染乳制品(等，EnterotoxigenicStaphylococcus aureus in bulk milk in Norway.Journal of AppliedMicrobiology.2005,99:158-166.)，影响乳制品的质量安全，同时对消费者带来安全隐患。耐药性金黄色葡萄球菌(MRSA、VRSA等)能在畜禽和人之间实现交叉感染，很多引起人类感染的MRSA菌株最终发现均来源于动物体内。另外，有研究表明，耐药性金黄色葡萄球菌能在畜禽和人之间实现交叉感染，很多引起人类感染的MRSA菌株最终发现均来源于动物体内。因而寻找新型抗菌物质取代或辅助传统抗生素以应对细菌耐药性问题至关重要。

抗菌肽(antimicrobial peptide)是广泛存在于生物体内具有抗菌活性的多肽，形成生物体第一道先天防御系统，对细菌、真菌、病毒和原虫等均具有杀灭作用。在诸多的抗菌肽中，真菌防御素的研究正逐渐受到关注。真菌防御素对革兰氏阳性细菌具有独特高效的杀菌作用，与传统抗生素之间不存在交叉耐受性，且对人的细胞没有毒害作用。真菌防御素易于通过基因表达进行大量生产，解决了抗菌肽生产成本高的问题。然而，现存的抗菌肽中，仅有0.46％来自真菌。因此，寻找真菌中天然抗菌肽并进行制备是本发明研究的重要内容。

发明内容

本发明的目的是提供烧土火丝菌天然抗菌肽及其应用。

为了实现本发明目的，本发明提供的烧土火丝菌天然抗菌肽，其特征在于，所述抗菌肽选自氨基酸序列分别如SEQ ID NO:5-8所示的多肽P1-P4中的任一个。

本发明还提供上述抗菌肽的编码基因，多肽P1-P4编码基因的核苷酸序列分别如SEQ ID NO:9-12所示。

本发明还提供表达盒、表达载体、克隆载体、转基因细胞系或工程菌，其包括包含编码所述抗菌肽基因序列的核酸。

本发明还提供一种重组毕赤酵母，其是用携带有所述抗菌肽编码基因的表达载体(例如pPICZαA)转化毕赤酵母工程菌，筛选阳性克隆得到的。

在本发明的一个具体实施方式中，所述重组毕赤酵母的构建如下：所述抗菌肽的编码基因经密码子优化后，在优化后的基因序列(分别如SEQ ID NO:9-12所示)的5’端添加XhoI酶切位点和Kex2切割位点，在3’端添加TAA和TAG终止子序列以及XbaI酶切位点，得到基因构建物，再将所述基因构建物插入载体pPICZαA的XhoI和XbaI酶切位点之间构建得到重组表达载体，最后用所述重组表达载体转化毕赤酵母菌X-33，筛选阳性克隆。

本发明还提供利用所述重组毕赤酵母发酵生产天然抗菌肽的方法，其是将上述的重组毕赤酵母发酵培养，分泌产生抗菌肽。

本发明还提供所述抗菌肽在制备广谱抗菌药物或组合物中的应用。