[发明专利]一种牛肉多肽的制备方法

权利要求书

1.一种牛肉多肽制备方法，其特征在于：该方法包括以下步骤：

(1)牛肉酶解物的制备：将新鲜牛肉使用绞肉机进行搅碎，而后置于反应器中，加入蒸馏水搅拌混匀，在温度50℃、pH8.5条件下，采用胰蛋白酶进行酶解，酶解后灭酶、过筛分离得到牛肉酶解物；

(2)牛肉多肽的超滤分离：将牛肉酶解物通过陶瓷膜设备过滤后，分别经过截留分子量5KD、2.5KD和1KD超滤膜超滤进行分级制备，收集1KD-2.5KD分子量的肽段(通过感官评价发现，该肽段最具牛肉风味，醇厚饱满)，低温冻干；得超滤肽段；

(3)牛肉多肽的凝胶分离：将步骤(2)得到的超滤肽段用去离子水进行复溶，超声处理，离心，取上清液，经过Sephadex G10凝胶分离，自动馏分收集器收集，每管收集4mL，收集管15～25的合并液；低温冻干，即得凝胶分离肽段；

(4)牛肉多肽的反相纯化：将步骤(3)得到的凝胶分离肽段，经过反相色谱纯化收集洗脱峰，分别收集保留时间为2.58min、2.72min洗脱液，多次进样，合并，然后冷冻干燥，得到肽段A和肽段B，肽段A、肽段B即为本发明的牛肉多肽。

2.根据权利要求1所述的一种牛肉多肽制备方法，其特征在于：所述牛肉酶解物的制备为：将新鲜牛肉使用绞肉机进行搅碎，称取搅碎后牛肉100g，放入500mL三口烧瓶中，加入100g水，加入胰蛋白酶，温度50℃、调节pH8.5、1.0‰添加量进行酶解，酶解2h后，于90℃灭酶15min，过80目筛网去除残渣，得到牛肉酶解液。

3.根据权利要求1所述的一种牛肉多肽制备方法，其特征在于：所述步骤(2)为：

陶瓷膜过滤：将牛肉酶解液加入罐中，打开泵进口阀、膜组件进出口阀门、回罐管路的阀门，启动循环泵，分批加入原料液，确保料罐内的液位正常，保证离心泵的稳定运行，打开组件渗透侧出口收集清液，操作压力控制为0.1-0.2Mpa；

超滤膜过滤：陶瓷膜预处理后的牛肉酶解液，由辅泵吸入，经主泵提高压力后送入膜组件，顺序为5KD、2.5KD和1KD超滤膜组件；

操作压力：5000分子量有机膜10～15bar、2500分子量有机膜12～16bar、1000分子量有机膜15～18bar；料液流速:20～60L/h，物料温度30～50℃；

首先打开5000Da超滤膜组件进口阀和出口阀，关闭2500Da和1000Da超滤膜组件进出口阀，收集一级透过液和截留液；一级透过液送入膜组件，打开2500ka超滤膜组件进口阀和出口阀，关闭5000Da和1000Da超滤膜组件进出口阀，收集二级透过液和截留液；二级透过液送入膜组件，打开1000Da超滤膜组件进口阀和出口阀，关闭5000Da和2500Da超滤膜组件进出口阀，收集三级透过液和截留液；

收集分离后的大于5KD、2.5-5KD、1-2.5KD和小于1KD这四段，-40℃进行冷冻干燥；选择1-2.5KD肽段进行凝胶分离。

4.根据权利要求1所述的一种牛肉多肽制备方法，其特征在于：所述步骤(3)为：

将步骤(2)得到的1-2.5KD样品用去离子水进行复溶(样品与去离子水质量比例为1：19)，超声处理，离心，取上清液，过0.2μm微孔滤膜得滤液，取0.5mL滤液过SephadexG-10(60cm×1cm)玻璃柱，以去离子为洗脱液，自动收集器收集，每管收集4mL，收集管号15～25的收集液，合并，-40℃进行冷冻干燥后，进行反相纯化。

5.根据权利要求1所述的一种牛肉多肽制备方法，其特征在于：所述步骤(4)为：

将步骤(3)低温冻干的样品用0.02％TFA的水复溶，超声，离心，取上清液；

反相纯化条件：Agilent1200HPLC；选用ZorbaxXDB-C18(4.6×250，5um)；柱温为30℃；流动相A为0.02％TFA，B为0.02％TFA的乙腈；流速为1.0mL/min；进样量为20μL；检测波长为220nm，分别收集保留时间为2.58min、2.72min洗脱液，多次进样，合并，然后冷冻干燥，得到肽段A和肽段B，肽段A、肽段B即为本发明的牛肉多肽。