[发明专利]一种热稳定性提高的L-氨基酸脱氨酶突变体及其构建方法

说明书

本发明公开了一种热稳定性提高的L‑氨基酸脱氨酶突变体及其构建方法，属于生物技术领域。本发明提供的L‑氨基酸脱氨酶的突变体D340N、L363N的Vmax和t_1/2都有提高。L‑氨基酸脱氨酶目前在多个领域有着广泛的应用，如在医药领域，可以作为手性拆分的氨基酸及其衍生物的催化剂，实现D\L‑氨基酸对映体分离。也可以催化L‑氨基酸脱氨合成相应的α‑酮酸。这些物质能在食品化工生物技术等领域都有重要的用途。本发明提高的L‑氨基酸脱氨酶突变体能够在如上领域更好的应用。

技术领域

本发明涉及一种热稳定性提高的L-氨基酸脱氨酶突变体及其构建方法，属于生物技术领域。

背景技术

L-氨基酸脱氨酶是一类以FAD为辅酶的黄素蛋白，能够催化L-氨基酸脱氨形成相应α-酮酸和氨。不同来源的L-氨基酸脱氨酶底物特异性差异巨大，一部分L-氨基酸脱氨酶能够利用多种L-氨基酸及氨基酸衍生物，然而有一些L-氨基酸脱氨酶的底物范围较小，甚至只能催化一种氨基酸，这时多数氨基酸脱氨酶会以底物的脱氨作用命名(如甘氨酸脱氨酶)。来自Proteus vulgaris的L-氨基酸脱氨酶可以利用多种氨基酸为底物，一般主要氧化具有长的脂肪族侧链或者芳香族的氨基酸。

L-氨基酸脱氨酶的应用广泛，可以催化L-氨基酸脱氨，形成相应的α-酮酸，不仅产量高，底物转化率高，而且转化过程易控制，目前已用于多种α-酮酸的生产。L-氨基酸脱氨酶可以用于从D\L-氨基酸混合物中，特异性催化L-氨基酸，实现D\L-氨基酸对映体分离。因此，通过分子改造来提高L-氨基酸脱氨酶的热稳定性以提高酶学性质更适合工业化应用的突变酶是目前的研究热点。

发明内容

本发明目的是为了提供一种酶活与热稳定性同时提高的L-氨基酸脱氨酶突变体及其构建方法，提高L-氨基酸脱氨酶的热稳定性，扩展了应用范围。

所述酶活与热稳定性同时提高的L-氨基酸脱氨酶突变体，具有SEQ IDNO.2所示的的氨基酸序列。

所述酶活与热稳定性同时提高的L-氨基酸脱氨酶突变体的构建方法，包括如下步骤：

(1)来自普通变形杆菌的L-氨基酸脱氨酶的突变位点确定：将L-氨基酸脱氨酶自N端的340位的天冬氨酸作为饱和突变位点。

(2)L-氨基酸脱氨酶突变体库的建立和突变体筛选：以携带编码所述来自普通变形杆菌的L-氨基酸脱氨酶的基因的重组质粒为模板，在第340位的密码子用NNK替代，设计兼并引物，进行全质粒PCR反应，构建定点饱和突变体库，Dpn I消化模板，纯化后产物直接转入大肠杆菌，将转化后的大肠杆菌涂布于含有50μg/mL的卡纳抗生素平板上，37℃培养16h，得到饱和突变体库。

(3)取2个饱和突变体库的菌落接种到含有卡纳的LB培养基的96孔板中，于37℃过夜培养，得到突变体库的种子液，以2％接种量转接到2块含有600μL TB培养基的96孔深孔板中，于37℃和900rpm的多孔板摇床上培养1.5h，加入终浓度为0.4mmol·L^-1的IPTG，37℃诱导4h后离心收集菌体。

(4)将步骤(3)培养获得的菌体，接种于含有卡纳抗生素的LB液体培养基中，37℃过夜培养，以2％的接种量接种到TB培养基中，培养到OD₆₀₀为0.6～0.8时，加0.4mM IPTG诱导，离心收集菌体，采用磷酸盐缓冲液悬浮菌体后，超声破碎，采用1％的曲拉通X-100装配膜蛋白，上清液通过Ni-NTA亲和柱纯化，透析去除咪唑，即可得到纯的L-氨基酸脱氨酶。

进一步的，步骤(2)中大肠杆菌为E.coli BL21(DE3)。

进一步的，步骤(2)所述的重组质粒为pET28a-lad。

进一步的，步骤(2)中全质粒PCR的条件为：98℃2min；然后98℃10s，55℃5s，72℃90s，共计25个循环；最后72℃10min。