[发明专利]一种血清7型副猪嗜血杆菌天然弱毒菌株及其应用

权利要求书

1.一种血清7型副猪嗜血杆菌天然弱毒菌株，其特征在于，所述血清7型副猪嗜血杆菌天然弱毒菌株于2017年11月22日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为：CCTCCM2017706，分类命名：副猪嗜血杆菌HPS1712；所述菌株对仔猪的最高攻毒剂量为1.0×10¹³CFU；

所述血清7型副猪嗜血杆菌天然弱毒菌株的应用为利用血清7型副猪嗜血杆菌天然弱毒菌株制备治疗副猪嗜血杆菌病的疫苗；所述疫苗的制备方法，包括如下步骤：

S1.菌体培养：

将副猪嗜血杆菌HPS1712菌株的菌粉接种于TSA/V/S固体培养基分区划线，37℃培养24h；挑取单菌落重新接种TSA/V/S固体培养基传3～5代，37℃培养12～16h然后挑取平板上单菌落接种于TSB/V/S液体培养基活化12h，进行纯粹检验合格后，转接到大瓶TSB/V/S液体培养基，37℃，170rpm摇床振荡扩大培养12h；所述TSA/V/S及TSB/V/S培养基为含5％牛血清，0.2％NAD的培养基；

S2.菌体收集：

将步骤S1中液体培养的菌液移入无菌离心管中，离心，弃上清，得到菌体沉淀，用配得的保护剂重悬菌体沉淀；所述保护剂为含脱脂乳9.12％、海藻糖2.87％、甘油2.96％的悬液，经116℃高压蒸汽灭菌20分钟后使用；

S3.冻干：

取混匀后的菌悬液分装入无菌带塞的青瓶中，-80℃预冻8h，然后取出立即放入真空冻干机中开始冻干；冻干样品取出后放入-20℃冰箱保存备用；使用时恢复至室温后加入20％氢氧化铝胶生理盐水进行稀释。

2.根据权利要求1所述的一种血清7型副猪嗜血杆菌天然弱毒菌株，其特征在于，所述步骤S1中，按菌液与培养基的体积比1:100，将单菌落接种到大瓶TSB/V/S培养基扩大培养。

3.根据权利要求1所述的一种血清7型副猪嗜血杆菌天然弱毒菌株，其特征在于，所述步骤S2中离心条件为6000rpm离心10min。

4.根据权利要求1所述的一种血清7型副猪嗜血杆菌天然弱毒菌株，其特征在于，所述步骤S3中冻干条件为真空度0.37mbar，冷凝器温度为-55℃，真空干燥时间为25h。

5.根据权利要求1所述的一种血清7型副猪嗜血杆菌天然弱毒菌株，其特征在于，所述步骤S3制备的疫苗，使用时恢复至室温后加入20％氢氧化铝胶生理盐水稀释至含活菌2.0×10⁷～2.0×10¹⁰CFU/mL。