[发明专利]一种聚唾液酸的检测方法

说明书

本发明公开了一种聚唾液酸的检测方法，该方法直接取微量的聚唾液酸生产菌株培养菌液滴到点样滤纸的样品检测区，经显色液显色后，用醋酸水溶液清洗掉未结合的显色液，直接对比点样滤纸上标准品的颜色，找出标品对照区中与样品颜色深浅接近点位，该点位对应的聚唾液酸标准品浓度即为培养菌液中聚唾液酸浓度。本发明发明操作简单，发酵过程中随时可以监控产生聚唾液酸的含量，样品采集量很少，仅5μL就可以检测结果，且检测仅需要5分钟，全过程不需要离心，不需要乙醇沉淀过滤，不需要除去杂蛋白，不需要各种仪器，且培养菌液中所含的杂质对检测结果影响不大，聚唾液酸不需要纯化可以直接检测，不受发酵液及其菌体影响。

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种聚唾液酸的检测方法。

背景技术

聚唾液酸(Polysialic acid，Colominic acid)是N-乙酰神经胺酸以α-2,8和/或α-2,9键连接的直链同聚物。以α-2,8糖苷键形式连接的聚唾液酸末端相邻的两个单体形成内酯，对聚唾液酸的稳定起到一定作用，这也是聚唾液酸大多以α-2,8糖苷键形式连接的原因之一。

聚唾液酸大都以N-乙酰神经氨酸为组成单元，因此在理化特性上与其相似，聚唾液酸易溶于水，在水溶液中很稳定，4℃可以存放几个月，不溶于乙醇、乙醚等有机溶剂，其热稳定性好，在酸性或碱性的环境中易被降解。

目前微生物发酵法是获得聚唾液酸的唯一途径。现阶段报道的聚唾液酸生产菌株以大肠杆菌居多，这些菌株在固体培养时，大多数菌落形态不规则，中间有凸体，边缘呈锯齿状，菌落表面呈湿润透明状；在液体培养时，菌体表面的聚唾液酸大都以电荷吸附的方式覆盖在细胞表面，大部分比较容易释放到培养液中，但是有一部分聚唾液酸以磷脂键的形式锚在细胞膜上，不易从细胞表面脱落。通常在微生物发酵过程中要随时监控聚唾液酸的含量，现有的检测方法是间苯二酚法，具体检测方法是：发酵液→离心→取上清(加氯化钠加过量乙醇)→沉淀(加去离子水)→溶解→去除杂蛋白(碱性蛋白酶，十六烷基吡啶)→络合物沉淀→解离→聚唾液酸沉淀(加过量乙醇)→溶解层析分离(加去离子水)→洗脱液→透析液→聚唾液酸→间苯二酚法检测→对照标准曲线分析计算结果。此法操作较为复杂，步骤比较多，检测需要10小时以上，而且需要仪器，每次取样量较多，不太适合实时监测。

发明内容

本发明所要解决的技术问题在于提供一种操作简单，快捷迅速，能在较短的时间内检测出菌株产生聚唾液酸含量的方法。

解决上述技术问题所采用的技术方案由下述步骤组成：

1、将聚唾液酸标准品加入去离子水中，分别配制不同浓度的聚唾液酸标准品溶液，取2～10μL不同浓度的聚唾液酸标准品溶液均匀滴加到点样滤纸的标品对照区的对应浓度点位上，自然晾干或吹风机吹干。

2、取与标准品溶液相同体积的聚唾液酸生产菌株培养菌液，滴加到点样滤纸的样品检测区的点位上，自然晾干或吹风机吹干。

3、将整个点样滤纸浸泡到显色液中，反应20～30秒，取出点样滤纸甩掉显色液，然后将点样滤纸浸泡到洗脱液中，在脱色摇床上洗涤30～60秒倒掉洗脱液，用洗脱液再重复洗涤2～3次，最后用自来水冲洗点样滤纸，自然晾干或用吹风机吹干。

4、将样品检测区与标品对照区进行对比，找出标品对照区中与样品颜色深浅接近点位，该点位对应的聚唾液酸标准品浓度即为培养菌液中聚唾液酸浓度。

上述的显色液是溶解有阿尔新蓝的醋酸水溶液，显色液中阿尔新蓝的浓度为0.9～1.8mg/mL，溶解阿尔新蓝所用的醋酸水溶液中醋酸的体积分数为2％～3％。

上述的洗脱液是质量分数为8％～15％的醋酸水溶液。