[发明专利]一种整合microRNA和CAR功能的载体构建方法

说明书

本发明涉及一种整合microRNA和CAR功能的载体构建方法，能在表达microRNA(以hsa‑miR‑301a为例)模拟物或阻遏物的同时表达CD19‑CAR的基于pFIV载体的pFIV‑microRNA(miR‑301a)‑CD19CAR系统；通过引入microRNA模拟物或阻遏物到携带有CAR序列的载体中，实现同时表达microRNA基因调控功能和肿瘤特异性抗原CD19的CAR，从而实现双重对T细胞的基因编辑和修饰功能，从而制备出新一代的具有更高安全性和有效性的CAR，更加适用于临床研究。

技术领域

本发明涉及pFIV-miR-301a-CD19CAR系统构建技术，特别是涉及一种共同表达hsa-miR-301a模拟物或阻遏物，和表达CD19-CAR的基于pFIV载体的pFIV-miR-301a-CD19-CAR系统构建方法。

背景技术

嵌合抗原受体技术(ChimericAntigenReceptor，CAR)是利用基因编辑技术，使T细胞表达肿瘤特异性嵌合抗原受体，以非主要组织相容性复合体(MHC)限制的方式结合肿瘤抗原，对肿瘤起到杀伤作用。CAR的结构主要包括四部分：细胞外的抗体单链可变区(可特异性结合肿瘤相关抗原)，胞外铰链区，跨膜结合区和活化T细胞的胞内信号区。第I代CAR介导的T细胞激活是通过CD3ζ链或FcRγ的酪氨酸激活基序完成，但是第I代CAR无法完全激活T细胞，也难以维持T细胞的持久增殖及细胞杀伤作用。第II代CAR增加了共刺激结构分子如CD28或CD137(4-1BB)，引入CD28信号肽可以引起T细胞的增殖，提高IL-2和IFN-γ的水平，而引入CD137信号肽使得T细胞的扩增及杀伤肿瘤活性更持久。第III代CAR除了CD3ζ和CD28两种信号分子，还增加了多种不同的信号分子结构来调节T细胞增殖和杀伤毒性等，如经典的CD28和4-1BB联合使用，以及包含共刺激结构分子OX40(TNFRSF4)和ICOS的联合使用，都可以增加体内肿瘤细胞消退。迄今为止，引入共刺激分子信号的第二代和第三代CAR，提高了T细胞的细胞毒性、体内增殖活性、持续存活时间和增加细胞因子释放等功能。与普通的免疫细胞治疗相比，CAR-T技术具有许多独特的优势，如CAR能非MHC依赖性识别肿瘤抗原，不需要经过APC。肿瘤表面蛋白类和脂类抗原都可以作为靶点；有共刺激分子，能有效增强T细胞增殖。因此该技术被认为是有望彻底攻克人类癌症的独特方法。

目前，CAR-T免疫治疗已在许多临床实验上取得巨大进展。其中，针对B相关抗原CD19阳性的B细胞恶性肿瘤，如急性B-淋巴细胞白血病(B-ALL)，慢性B-淋巴细胞白血病(B-CLL)，B细胞霍奇金氏淋巴瘤(B-HL)和非霍奇金氏淋巴瘤(B-NHL)，CAR-T-CD19T细胞免疫治疗疗效显著，已有报告显示CAR-T-CD19治疗在成人和儿童复发和难治性B-ALL中可以获得高达90％的完全缓解率(Completeremission，CR)。研究报告也显示，几种用不同结构设计的CAR-CD19的临床试验治疗都显示了相似的良好疗效。有些患者经CAR-T治疗后还获得了持久性缓解，不需要额外的其他治疗。虽然CAR-T细胞免疫疗法在多种恶性肿瘤的治疗中取得了很好的疗效，但在治愈肿瘤患者的同时也带来诸多不良反应，如CAR-T细胞在清除肿瘤的同时也会攻击正常组织，治疗同时会产生大量细胞因子导致患者多器官功能衰竭等，临床已有致死病例的报道。目前，CAR-T细胞免疫治疗还处于发展阶段，在血液系统恶性肿瘤和实体瘤的治疗中还有很大的发展空间，对CAR结构进行优化改进，在提升CAR-T细胞抗肿瘤能力的同时减少其不良反应，将为CAR-T细胞免疫治疗的大规模临床应用提供新的思路和方向。